【摘 要】
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在动物体内成肌细胞的分化对于骨骼肌发育起着十分重要的作用,而成肌细胞的分化是一个十分复杂的过程,受到多种信号通路及信号分子的调节。已知细胞外基质(ECM)能够参与调节细胞形态、细胞运动和细胞分化等生物学过程,在细胞生命活动中具有重要作用。SPARCL1作为一种细胞外基质蛋白,已知SPARCL1与小鼠成肌细胞C2C12的分化有关,但是SPARCL1在调节C2C12细胞分化中的具体作用机制尚不清晰。所
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在动物体内成肌细胞的分化对于骨骼肌发育起着十分重要的作用,而成肌细胞的分化是一个十分复杂的过程,受到多种信号通路及信号分子的调节。已知细胞外基质(ECM)能够参与调节细胞形态、细胞运动和细胞分化等生物学过程,在细胞生命活动中具有重要作用。SPARCL1作为一种细胞外基质蛋白,已知SPARCL1与小鼠成肌细胞C2C12的分化有关,但是SPARCL1在调节C2C12细胞分化中的具体作用机制尚不清晰。所以本实验以SPARCL1基因为研究对象,阐明了SPARCL1通过BMP7介导的BMP/TGF-β信号通路调节C2C12细胞分化的生物学机制。研究方法、内容及结论:(1)利用CRISPR/Cas9技术及si RNA干扰技术分别激活和抑制SPARCL1基因的表达,Western blotting结果表明,SPARCL1的激活或抑制可上调或下调分化标志分子结蛋白(Desmin)及肌细胞生成素(myogenin,Myo G)的表达水平;免疫荧光结果表明,激活或抑制SPARCL1同样上调或下调了细胞的肌管融合率。以上结果表明SPARCL1能够影响C2C12细胞分化。(2)本研究采用盐酸布比卡因注射实验,建立小鼠肌肉损伤修复的动物模型。HE染色结果表明,盐酸布比卡因诱导的肌肉损伤修复模型建立成功。SPARCL1免疫荧光结果表明,在损伤最严重时(D3),SPARCL1的表达量最高,当损伤修复完成时(D14),SPARCL1表达水平降低;Western blotting结果表明,SPARCL1的蛋白表达水平与免疫荧光染色具有类似的结果,即在(D3)时表达量处于较高水平,而在(D14)时下调为较低水平,提示SPARCL1可能参与小鼠的肌肉损伤修复过程。(3)免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)实验检测结果表明,在C2C12细胞分化过程中SPARCL1与BMP7相互结合。(4)采用Western blotting及免疫荧光检测BMP7在C2C12细胞分化过程中的表达变化。结果发现,BMP7蛋白的表达量呈现逐步增加的趋势;BMP7的免疫荧光结果发现,BMP7在分化的肌管中的表达水平同样随着细胞分化天数的增加而不断增加。表明,BMP7可能参与C2C12细胞分化过程。(5)利用CRISPR/Cas9及si RNA技术分别激活和抑制BMP7基因的表达,Western blotting结果发现BMP7的激活或抑制可影响Myo G及Desmin的表达水平;免疫荧光结果发现,激活BMP7后肌管融合率增加;抑制BMP7后肌管融合率降低,表明BMP7可影响C2C12细胞分化。(6)利用CRISPR/Cas9技术及si RNA干扰技术分别激活和抑制SPARCL1基因的表达,Western blotting检测SPARCL1对BMP7基因及BMP/TGF-β信号通路的影响。结果发现,SPARCL1的激活或抑制可上调或下调BMP7表达水平,同时BMP/TGF-β通路的活性分子P-SMAD4的表达水平也随之升高或降低,并且细胞分化分子Myo G、Desmin的表达水平也被上调或下调,表明SPARCL1可能通过调控BMP7及BMP/TGF-β信号通路的活性影响C2C12细胞分化。(7)为了阐明SPARCL1是否通过BMP7调节BMP/TGF-β信号通路并影响C2C12细胞分化,本研究激活SPARCL1基因表达的同时抑制BMP7基因的表达。Western blotting结果表明,由于BMP7的抑制,SPARCL1的激活没有增加BMP/TGF-β通路的活性,也没有提高Myo G、Desmin的表达水平;免疫荧光结果显示,由于BMP7的抑制,SPARCL1的激活没有增加细胞分化的肌管融合率。表明SPARCL1可通过BMP7介导的BMP/TGF-β信号通路来影响C2C12细胞分化。综上,SPARCL1可通过BMP7介导的BMP/TGF-β信号通路影响C2C12细胞分化。这一发现,有助于我们深入了解SPARCL1调节肌肉发育的分子机制,并为肌肉损伤疾病的治疗提供新的研究思路。
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