背景:胆管癌（CCA）是肝胆肿瘤中最常见、最严重的恶性肿瘤之一。中国是全世界范围内胆管癌的高发地区。胆管癌是一类异质性极高的肿瘤,它的异质性主要体现在:解剖位置的异质性;致病机制的异质性;肿瘤细胞起源的异质性以及基因组学的异质性。这些异质性大大增加了我们对胆管癌的诊治难度。目前,针对胆管癌的主要治疗方式为根治性的手术切除。然而,由于胆管癌起病隐匿,恶性程度高,肿瘤迅速侵犯临近脏器和重要血管,或者发生远处转移。多数患者在初次就诊时便已属终末期,失去手术机会。近些年来,迅速发展的分子靶向治疗使得胆管癌的精准治疗成为可能。FGFR2突变及IDH1/2突变是肝内胆管细胞癌（i CCA）的常见突变位点,而针对这两个突变靶点的分子靶向药物在i CCA的治疗中发挥了不俗的效果。然而,肝外胆管癌展现出与肝内胆管癌不同的突变图谱,FGFR2突变及IDH1/2突变在肝外胆管癌中相当罕见。HER2过表达/扩增,这一在乳腺癌、胃癌治疗中起到重要作用的靶点,在肝外胆管癌中发生率较高,是肝外胆管癌的潜在的可靶向的位点。人表皮生长因子受体2（HER2）是人表皮生长因子受体家族的成员之一,被认为广泛参与了肿瘤细胞的凋亡抑制、增殖、分化和侵袭。已有研究表明,曲妥珠单抗联合帕妥珠单抗的治疗可使HER2阳性的胆管癌患者生存获益。针对HER2的靶向治疗除单抗类药物以外,还包括了酪氨酸激酶抑制剂这一类小分子药物。拉帕替尼,是最早研发的针对HER2靶点的酪氨酸激酶抑制剂,在HER2阳性乳腺癌和胃癌的治疗中亦取得了不错的效果。既往曾有临床实验报道了拉帕替尼在胆管癌中的治疗效果欠佳,然而这部分临床研究中并没有纳入HER2阳性的胆管癌患者。在本项研究中,我们通过筛选HER2阳性的胆管癌细胞系并构建HER2阳性的胆管癌类器官,观察拉帕替尼对HER2阳性胆管癌细胞的抑制能力,并阐明拉帕替尼对其抑制的具体机制。除了能够抑制HER2及HER2下游信号通路外,另有研究证明酪氨酸激酶抑制剂能够抑制ATP结合盒蛋白B亚家族成员1（ABCB1）介导的多药耐药（MDR）。ABCB1在ATP供能下将进入到肿瘤细胞内的底物主动转运至细胞外,从而降低化疗药物的细胞毒作用。考虑到以吉西他滨为基础的化疗依然是终末期胆管癌患者的一线系统治疗方案,我们检验了拉帕替尼与吉西他滨在HER2阳性胆管癌治疗中能否起到协同效应。有研究表明,ABCB1表达上调与吉西他滨耐药密切相关,然而吉西他滨或其代谢物质是否为ABCB1的底物,以及拉帕替尼抑制ABCB1的具体机制尚未有研究系统化阐述。在本研究中我们进一步揭示了吉西他滨或其代谢产物与ABCB1的关系,以及拉帕替尼与吉西他滨在HER2阳性胆管癌治疗中起到协同效应的具体机制,为胆管癌的治疗寻找新的靶点和思路。研究方法:1、利用c Bio Portal数据库分析HER2在BTC中的扩增比例,并明确在BTC中,HER2扩增与HER2 RNA、HER2蛋白之间的表达相关性,分析HER2扩增与患者生存预后的关系;2、利用患者来源的胆管癌组织分离胆管癌细胞并培养胆管癌类器官后,我们从中选取了一株HER2阳性和2株HER2阴性的类器官进行拉帕替尼/拉帕替尼+吉西他滨的药物敏感性实验。3、利用蛋白免疫印迹及免疫荧光筛选出HER2阳性的胆管癌细胞系。4、通过Cell Titer-Glo方法绘制药物抑制曲线,明确拉帕替尼对HER2过表达/扩增胆管癌细胞的抑制效应以及拉帕替尼和吉西他滨是否具有协同效应。5、采用细胞周期、细胞凋亡流式检测,以及细胞周期相关蛋白、HER2及下游信号通路关键蛋白的Western-blot,探究拉帕替尼对HER2过表达/扩增胆管癌细胞的抑制机制。6、构建吉西他滨耐药细胞株,评估ABCB1在胆管癌耐药中发挥的作用。7、通过分子对接分析、ATPase实验,明确吉西他滨或者其代谢物质是否为ABCB1的底物。8、通过分子对接分析、ATPase实验及罗丹明转运实验探究拉帕替尼是否对ABCB1具有抑制功能。9、通过液相色谱串联质谱分析明确拉帕替尼是否能够通过抑制ABCB1功能,提高胆管癌细胞胞内吉西他滨或者其代谢物质浓度。研究结果:（1）胆道系统肿瘤中HER2的扩增频率和预后关系胆道系统肿瘤中HER2扩增率为4%左右,且其与肿瘤的m RNA、蛋白表达水平呈正相关（P<0.01）。HER2扩增的胆管癌增殖能力、侵袭能力更强（P<0.01）,导致了这部分患者预后可能更差。（2）拉帕替尼对HER2阳性胆管癌的抑制机制我们成功构建了HER2阳性的胆管癌类器官CC6062,并筛选出FRH-0201这一HER2阳性细胞系。与HER2阴性的胆管癌细胞相比,拉帕替尼对HER2阳性的类器官及细胞系更为敏感,其通过阻断HER2以及HER2下游信号通路,以浓度依赖和时间依赖的方式诱导HER2阳性胆管癌细胞的细胞周期阻滞和细胞凋亡。（3）拉帕替尼与吉西他滨在HER2阳性胆管癌治疗中的协同效应拉帕替尼联合吉西他滨较拉帕替尼、吉西他滨的单药对CC6062和FRH-0201的细胞增殖活性抑制作用更为显著,通过Calcu Syn2.0软件计算的拉帕替尼联合吉西他滨的协同指数均小于1,表明二者具有协同效应。（4）ABCB1上调是吉西他滨耐药的重要机制。吉西他滨作用于胆管癌细胞后诱导了ABCB1的表达上调,而吉西他滨的主要活性代谢物质d Fd CTP则是ABCB1的底物,会被诱导上调的ABCB1转运至胞外,从而减轻了吉西他滨对肿瘤细胞的细胞毒作用。这可能是胆管癌对吉西他滨耐药的重要机制之一。（5）拉帕替尼与吉西他滨的协同机制通过分子对接分析、ATPase实验及罗丹明转运实验,我们证实了拉帕替尼可以通过抑制ABCB1功能,减少d Fd CTP在胆管癌细胞内的外流,在胆管癌治疗中发挥与吉西他滨的协同作用。研究结论:（1）拉帕替尼通过对HER2及HER2下游信号通路的阻断诱导了HER2阳性胆管癌的细胞周期阻滞和细胞凋亡;（2）吉西他滨的活性代谢产物,d Fd CTP,是ABCB1的底物之一;（3）吉西他滨导致胆管癌细胞的ABCB1表达上调,d Fd CTP泵出增多,是胆管癌细胞吉西他滨耐药的重要机制之一;（4）拉帕替尼通过抑制ABCB1功能,减少d Fd CTP在胆管癌细胞内的外流,在胆管癌治疗中可与吉西他滨发挥协同作用。