目的:理论部分系统梳理不寐的历史源流、病因病机以及治疗方法,重点探讨培元养心安神法治疗不寐的理论依据。实验部分以睡眠和昼夜节律为切入点,以培元养心安神代表方安寐丹为干预用药,通过建立光照睡眠剥夺斑马鱼模型,主要围绕光照对斑马鱼睡眠、行为、学习记忆能力、生物钟基因和组织细胞结构的影响以及安寐丹对睡眠剥夺斑马鱼的干预作用展开研究,以期阐释睡眠剥夺对斑马鱼的影响以及安寐丹对其调控的机理,为中医药防治不寐提供思路与方法。方法:理论探讨:主要采用文献检索和古书籍整理的方法,收集不寐的有关文献,综合古今医家之言,系统梳理不寐的病名、病因病机以及治疗方法,分析中医学对“元气”的理解,从“元气”的概念、来源、分布、功能及与脏腑的密切关系,进行深入的阐述,探讨“元气”与睡眠的关系,并进一步提出“元气亏虚,心不藏神”是不寐的关键病机,分析其合理性和科学性,为选择安寐丹治疗不寐提供理论支撑,同时丰富中医药防治不寐的理论依据。并围绕光照和睡眠的关系,分析光照对昼夜节律的影响,为后续的实验研究提供理论指导和通路的选择依据。实验研究:选择健康的野生型AB系4月龄雄性斑马鱼为实验动物,实验过程中饲喂条件均按斑马鱼饲养规范进行。实验一为斑马鱼睡眠剥夺模型的建立与评价,观察光照对斑马鱼运动行为、学习记忆能力、生物钟基因以及脑部组织结构的影响,探索光照对斑马鱼进行睡眠剥夺模拟失眠的最佳条件,确立斑马鱼睡眠剥夺模型。实验二是斑马鱼药物最大耐受浓度的确定,主要是确定安寐丹和褪黑素给药的安全剂量范围。实验三为安寐丹对睡眠剥夺斑马鱼行为学及学习记忆能力的影响,利用斑马鱼行为学分析设备记录并分析各组斑马鱼的运动行为和学习记忆能力,并观察安寐丹对其的干预作用。实验四为安寐丹对睡眠剥夺斑马鱼脑部组织结构变化的影响,利用超微电镜对斑马鱼脑组织切片进行拍照观察,观察安寐丹对其的干预作用。实验五为安寐丹对睡眠剥夺斑马鱼生物钟基因的影响,利用RT-PCR技术对各组斑马鱼脑组织和肝脏组织中生物钟基因进行检测,比较其差异,分析其在一日中的表达水平和趋势变化,并探索安寐丹对其的干预作用。实验六为安寐丹对睡眠剥夺斑马鱼Alk-Smad3-Dec1时钟信号通路的影响,利用RT-PCR检测通路基因转录水平,Western Blot检测通路蛋白翻译水平,免疫荧光方法检测通路蛋白的表达情况。结果:理论探讨:元气亏虚,心不藏神是不寐发生的关键病机,培元养神安神法是防治不寐的重要方法。实验研究:实验一:（1）与对照组（Control group,记做CK组）斑马鱼对比,睡眠剥夺1天（Sleep deprivation for 1 day,记做SD1）、SD2、SD3组静息时间均增多,SD4SD7组斑马鱼静息时间未见明显变化。（2）CK组斑马鱼学习记忆能力较SD各组好,SD各组斑马鱼对比,SD1组斑马鱼学习记忆能力较SD2、SD3组斑马鱼好,SD2组斑马鱼学习记忆能力较SD3组斑马鱼好。（3）SD3组斑马鱼脑部per1a、per2、bmal1、cry1b m RNA表达水平与CK组相比,差异具有统计学意义。（4）透射电子显微镜镜下可见CK组斑马鱼大脑组织细胞结构完整,细胞核结构完整,线粒体丰富且结构完整,形态规则,板层状嵴存在,未见明显断裂,SD2及SD3组斑马鱼大脑组织细胞出现坏死现象,镜下可见细胞核塌陷,边界破解甚至溶解,染色质固缩,线粒体出现肿胀,甚至大量空泡,嵴断裂或大部分消失。实验二:安寐丹MTC为0.08 mg/ml,褪黑素MTC为0.4 mg/ml。实验三:（1）SD组斑马鱼总静息时间较CK组减少,AMD-H组斑马鱼总静息时间较SD组增多。（2）SD组斑马鱼的静息时间较CK组明显减少,我们将1个昼夜分为4个时间段,结果显示各组斑马鱼在不同的时间段运动具有差异性,且干预药物的有效性也存在时间段的差异。（3）CK组斑马鱼找到TA区的潜伏时间持续减少,而持续的光照SD显著影响了斑马鱼的学习记忆能力,给予安寐丹干预后这种损伤出现不同程度的恢复。（4）各组斑马鱼在被放入新鱼缸的时候均在鱼缸底部游动,SD组斑马鱼在底部游动时间较CK组长,在给予安寐丹干预后,斑马鱼焦虑行为较SD组有改善。（5）各组斑马鱼在镜面实验中都表现出明显的攻击行为,但SD组斑马鱼撞镜频次较CK组多,对其进行药物干预后,SD组斑马鱼这一症状并未出现改善。实验四:与CK组相比,SD组斑马鱼脑组织细胞结构出现异常,细胞核出现塌陷,核膜破裂甚至溶解,染色质固缩,线粒体出现肿胀,甚至大量空泡和积水样变,嵴断裂或大部分消失,并形成了致密的板层状髓鞘样结构。给予安寐丹和褪黑素干预后,斑马鱼脑组织细胞结构有所恢复,核膜较完整,染色质较均一化,线粒体空泡或肿胀情况减轻,部分嵴呈现完整表现,其中以AMD-H组斑马鱼细胞结构改善最为明显,几乎接近CK组状态,而AMD-L和MT组相对较差。实验五:（1）CK组斑马鱼脑组织中,clock1a、cry1a、per2的mRNA表达呈现出一定的节律性,即在光期表现出上升的趋势,在黑暗期表现出下降的趋势;per1a的m RNA表达从ZT06时间点开始,表现为下降-上升-下降的趋势,其峰值出现在ZT24这一时间点。在CK组斑马鱼肝组织中,clock1a的m RNA表达在光期呈现下降趋势,在黑暗期呈现上升趋势;cry1a的m RNA表达在光期呈现下降趋势,在黑暗中则无明显变化;per1a和per2的m RNA表达均从ZT06时间点开始,表现为下降-上升-下降-上升的趋势,其峰值出现在ZT18这一时间点。SD组斑马鱼脑组织和肝脏中per1a、per2、clock1a、cry1a m RNA的表达在各个时间节点均上调,但其表达的趋势仍与CK组斑马鱼保持一致,但是无论是在斑马鱼脑组织还是肝脏中,per1a m RNA的相对表达量不仅出现改变,其相位也出现提前的改变,安寐丹干预后以上变化均出现不同程度的改善。（2）肝脏的生物钟基因相对表达量整体较脑组织高,且部分生物钟基因出现节律紊乱。实验六:（1）CK组的alk5、smad3、smad4、dec1、dbp的m RNA表达呈现出一定的节律性,5个基因的表达在黑暗期有逐渐上升的趋势,而cry1a基因的m RNA表达在黑暗期呈现出逐渐下降的趋势;alk5、smad4、dec1、dbp、cry1a的m RNA表达在光期逐渐上升,smad3的m RNA表达在光期逐渐下降。alk5、smad3、smad4、dec1、dbp的m RNA表达在由光期进入黑暗期的时候均呈下降趋势。SD组节律相对紊乱,各基因在光暗期间的趋势出现改变,各个时间点alk5、smad3、smad4、dec1、dbp、cry1a的m RNA表达量均较CK组升高,安寐丹和褪黑素干预后斑马鱼节律出现改善。（2）CK组Alk5、p-Smad3和Dec1蛋白的表达均在光期呈现逐渐下降的趋势,在暗期表现出逐渐上升的趋势;SD组Alk5、p-Smad3和Dec1蛋白表达的节律紊乱,同时在各个时间点总体表达量均上升,各个指标在我们固定的4个时间点表达也各有差异,给予安寐丹和褪黑素干预后以上情况得以不用程度的恢复。（3）与CK组比较:Alk5和p-Smad 3在SD组各个时间点荧光强度均明显增强。Dec 1在SD组ZT12、ZT18白昼时间点荧光强度明显增强,在ZT6、ZT24黑夜时间点荧光强度减弱。与SD组比较:给予安寐丹的各组斑马鱼在不同时间点上Alk5和p-Smad3荧光强度基本都有减弱,且不呈现剂量依耐性,说明安寐丹可能会抑制Alk5的表达,但与剂量无关。同样的脑组织切片中,将p-Smad 3和Dec 1进行双色标记,将Dec 1蛋白标记为红色荧光,将p-Smad 3蛋白标记为绿色荧光。与CK组比较:p-Smad 3和Dec 1在SD组各个时间点荧光强度均明显增强。与SD组比较:给予安寐丹和褪黑素的各个给药组p-Smad3和Dec 1在各个时间点的荧光强度均有不同程度的减弱,且与安寐丹不呈剂量依赖。结论:（1）《黄帝内经》以阴阳消长变化为出发点,以营卫运行为基础,确立了以营卫阴阳为主要理论的睡眠学说,后世对睡眠理论的不断发展和继承,总结出阴阳失调,营卫失常,脏腑失和为不寐的主要病机,深挖其病机,均寓有元气不足,心不藏神的机理在其中,阴阳协调有度,营卫运行有道,脏腑活动有序,均需要元气的推动和调控。因此我们进一步从整体出发再次剖析不寐的病机,归纳总结出元气亏虚,心不藏神是不寐的关键病机,基于此我们确立了培元养心安神治法为治疗不寐的重要方法,其代表方为安寐丹。（2）对4月龄的雄性斑马鱼进行持续3 d的光照,结果发现光照后的斑马鱼出现明显的运动时间及行为改变、学习记忆能力下降、生物钟基因改变以及脑部组织结构的改变。（3）安寐丹能够纠正由于持续光照导致的斑马鱼静息时间减少,改善睡眠剥夺斑马鱼的运动行为模式、学习记忆能力、焦虑行为和攻击行为。（4）安寐丹对SD斑马鱼受损的脑部组织细胞结构具有恢复作用,并且这种恢复作用与安寐丹的给药剂量表现出剂量依赖关系。（5）同一时钟基因在斑马鱼的脑组织和肝脏中表达具有较大的差异,在持续3 d的光照后,斑马鱼脑组织和肝脏中per1a、per2、clock1a、cry1a m RNA的表达在各个时间节点均上调,且节律出现紊乱,安寐丹干预后能够不同程度的下调其表达并恢复其节律。（6）安寐丹可以改善Alk-Smad3-Dec1通路蛋白表达水平,安寐丹可能是通过该途径发挥改善斑马鱼睡眠和昼夜节律的作用。