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局灶性脑缺血是威胁人类健康的主要疾病之一。局灶性脑缺血发生后,病人大脑中动脉及其分支发生阻塞,阻碍血管流通,造成缺氧、缺能量的状态;并诱发活性氧的释放、氨酸中毒、炎症反应等造成大脑不可逆损伤。目前为止,溶栓治疗是这类疾病最有效的措施,但是,溶栓治疗时间窗很窄,并不是理想的最佳手段。所以提高局灶性脑缺血的治疗效果,降低患者死亡率,成为目前研究的首要问题。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylase inhibitor,HDACi)丁酸钠(Sodium butyrate,NaBu)是短链脂肪酸丁酸的钠盐。在局灶性脑缺血动物模型中,NaBu可减少脑梗死面积,缩小脑水肿大小,抑制IL-1β和IL-8等炎性因子的表达,但其在局灶性脑缺血中的抗炎机制尚未阐明。研究发现,脑缺血可异常激活NLRP3炎性小体,促进细胞分泌生物活性的炎性因子,诱导细胞凋亡。NLRP3炎性小体被激活后,会激活产生炎性因子IL-1β,诱导细胞凋亡。前期研究发现,大脑中动脉阻塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠模型中,缺血性损伤诱导了NLRP3炎性小体激活,IL-1β等炎症因子分泌增加,而抑制NLRP3表达可缓解缺血引起的脑损伤,提示NLRP3活化过程是脑缺血损伤的治疗靶标之一。Nur77蛋白是孤儿核受体超家族中的一员。Nur77的表达可能通过调控炎症因子参与动脉粥样硬化等心血管疾病的发生和发展。在动脉粥样硬化疾病动物模型中,上调小胶质细胞中Nur77表达水平,可抑制促炎基因iNOS、IL-1β、TNF-α等的表达。Nur77的表达受到组蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性的调控,抑制HDAC在Nur77启动子区域的募集,可促进Nur77表达。亦有研究证明,Nur77参与脑缺血损伤的发生,但其表达的调控机制及缺血性损伤中的抗炎机制尚未阐述清楚。综上所述,我们推测,HDACi丁酸钠可能通过调控脑组织中Nur77表达,抑制缺血性脑损伤引起的炎症反应,而NLRP3炎性小体作为缺血性脑损伤主要影响的炎症反应组成,可能是Nur77的主要作用靶点。研究目的:本研究拟明确丁酸钠对局灶性脑缺血引起脑损伤的保护机制:通过体内外实验,探讨HDACi丁酸钠基于Nur77通路的活化,抑制NLRP3炎性小体表达,减轻MCAO引起的脑损伤。实验方法:本实验动物部分,选取250-280g的Wistar雄性大鼠,对其进行大脑中动脉阻塞造模方式,模拟脑缺血条件。采用预防给药方式,术前7d连续给与丁酸钠(300mg/kg)。术后24h取材。采用TTC染色的方法,检测脑缺血大鼠脑梗死面积;采用longa法,对脑缺血大鼠进行神经学评分;采用HE染色法,观察脑缺血大鼠的脑组织形态;采用石蜡片免疫组化的方法,观察脑缺血大鼠脑组织中巨噬细胞浸润数量。采用Western blot,qPCR的方法,检测模型大鼠脑组织中NLRP3蛋白的变化。对模型大鼠采用术后30min给药的方式,给予Csn-B(15mg/kg、30mg/kg),术后24h取材,采用Western blot方法检测上调Nur77对NLRP3蛋白的影响。采用Western blot方法检测丁酸钠对脑缺血大鼠脑组织中Nur77、NLRP3、Caspase1、IL-1β、ERK、p-ERK、CREB、p-CREB蛋白的影响;采用qPCR方法检测丁酸钠对脑缺血大鼠脑组织中Nur77、NLRP3、Caspase1、IL-1β、ERK、CREB mRNA的影响。细胞实验部分,采用HT22细胞系,建立氧糖剥夺模型(Oxygen and glucose deprivation,OGD),采用MTT方法,测定丁酸钠在HT22细胞中的最佳给药浓度;采用Western blot实验方法,检测OGD条件下HT22细胞中Nur77,NLRP3,IL-1β,Caspase1,ERK,p-ERK,CREB,p-CREB的蛋白表达水平;采用细胞免疫荧光技术,检测OGD条件下HT22细胞中Nur77,NLRP3蛋白荧光强度。最后同时给予细胞丁酸钠与Csn-B,Western blot检测Nur77与NLRP3的蛋白表达。实验结果:(1)给予大鼠丁酸钠后,建立MCAO模型。TTC染色结果显示,丁酸钠能降低脑梗死面积;longa法评分结果显示,丁酸钠能降低神经学评分;HE染色结果显示,丁酸钠能改善脑组织神经元细胞形态;免疫组化实验结果显示,丁酸钠减轻脑组织神经股皱缩,核固缩等现象。(2)建立MCAO脑缺血损伤模型,Western blot结果显示:与CON组相比,MCAO大鼠脑组织中NLRP3蛋白表达水平上升。给予MCAO大鼠不同浓度Nur77激动剂Csn-B,可剂量依赖型降低NLRP3的表达水平,且高浓度的CsnB可较显著地降低NLRP3的表达。(3)给予大鼠丁酸钠后,建立MCAO模型。Western blot与qPCR结果显示:丁酸钠能改善脑缺血造成的Nur77,p-ERK蛋白,mRNA表达下降;降低脑缺血造成的NLRP3,IL-1β,Caspase1的高表达;对ERK,p-CREB,CREB蛋白无影响。(4)建立HT22细胞OGD模型。MTT结果显示:丁酸钠的最佳给药浓度为1mM;Western blot结果显示:丁酸钠能改善OGD造成的Nur77,p-ERK蛋白表达下降;减弱OGD造成的NLRP3,IL-1β,Caspase1蛋白表达上升;对ERK,p-CREB,CREB蛋白无影响。细胞免疫荧光结果显示:丁酸钠能改善OGD造成的Nur77蛋白荧光强度下降;减弱OGD造成的NLRP3蛋白荧光强度上升。Western blot结果显示丁酸钠通过对Nur77的调节,抑制NLRP3炎性小体的表达。实验结论:(1)丁酸钠可减少局灶性脑缺血大鼠梗死面积,降低神经学评分,保护神经元形态;提高氧糖剥夺条件下HT22细胞的存活率。(2)丁酸钠通过上调Nur77蛋白的表达,抑制NLRP3的表达,保护大鼠局灶性脑缺血损伤。