鳗鱼骨胶原蛋白ACE抑制肽的制备及活性研究

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鳗鱼是营养丰富的水产品,在我国水产养殖中占有重要地位,2020年我国鳗鱼的养殖产量达25.07万吨。烤鳗是鳗鱼的主要加工产品,烤鳗加工过程中会产生鱼头、鱼骨等富含蛋白质的副产物,一般用于饲料的原料或被丢弃,精深加工研究较少。鱼骨中含有丰富的胶原蛋白,充分利用可提高鳗鱼加工副产物的附加值。本文通过酶法从鳗鱼骨中提取胶原蛋白,将胶原蛋白定向酶解后得到具有较好血管紧张素转化酶(Angiotensin-converting enzyme,ACE)抑制活性的酶解产物,进而用超滤法对酶解产物进行分离纯化,采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行氨基酸序列鉴定,通过分子对接阐明氨基酸序列与ACE分子间之间的相互作用,并考察其热和p H稳定性,合成两条高活性多肽并通过探究其对人脐静脉内皮细胞调控因子的影响揭示其作用机制。主要研究结果如下:(1)以鳗鱼骨为原料对胶原蛋白提取工艺的进行研究。通过氨基酸组成分析、红外吸收、差示扫描量热法、热重分析以及扫描电镜等方法分析胶原蛋白的理化性质。结果表明:最佳提取条件为加酶量1%、提取时间为2 h,料液比为1:40,提取率为24.17%;氨基酸组成分析表明胶原蛋白中甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸含量较高,分别为20.11%、10.72%和7.48%;红外图谱显示胶原蛋白具有酰胺A、酰胺B、酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅱ带、酰胺Ⅲ带的特征吸收峰;差示扫描量热法测定显示胶原蛋白的变性温度为80.29℃;热重分析显示在329.6℃处具有最大失重速度;扫描电镜显示胶原蛋白多孔、多层聚集结构。(2)以鳗鱼骨胶原蛋白为原料,采用酶解法制备ACE抑制肽。以ACE抑制活性和水解度为评价指标,通过单因素和响应面试验确定最佳的酶解制备条件,并分析其分子质量分布和氨基酸组成。结果显示,碱性蛋白酶为最佳水解酶,最佳酶解条件为温度50℃、胶原蛋白质量浓度为1.5 g·(100 m L)–1、酶解时间5.25 h、加酶量3.1%、p H 9.2。在此条件下,鳗鱼胶原蛋白酶解产物的ACE抑制活性为70.33%;酶解产物中分子质量小于1 000 Da的肽段占57.02%,1 000~3 000 Da的肽段占36.55%;氨基酸组成分析表明,酶解产物中与ACE抑制活性有关的疏水性氨基酸(如脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸)含量增加。(3)以ACE抑制活性为评价指标,采用超滤法对鳗鱼骨胶原蛋白酶解产物进行分离纯化,采用LC-MS/MS分析其氨基酸序列和分子质量,分析多肽理化性质和生物活性,并对其进行分子对接。结果表明,酶解产物经过分离纯化得到3个组分(F1、F2和F3),其中F2组分ACE抑制活性最高,为79.33%。从F2组分中鉴定得到8种具有潜在的ACE抑制活性的氨基酸序列GPIGPPGPR、PMGPR、GPAGPAGPR、GPPGPPGL、GPMGPR、GPAGPR、GPSGAPGPR和GGPGPSGPR,IC50分别为1.441mg·m L-1、1.47 mg·m L-1、0.627 8 mg·m L-1、0.370 mg·m L-1、2.247 mg·m L-1、1.246 mg·m L-1、1.022 mg·m L-1和0.758 2 mg·m L-1,均无毒性。(4)以多肽GPAGPAGPR和GPPGPPGL为原料,对p H、温度以及模拟胃蛋白酶和胰蛋白酶消化稳定性进行研究。以人脐静脉内皮细胞为模型,考察多肽对细胞内调控因子的影响。结果表明:多肽GPAGPAGPR和GPPGPPGL具有较好的热稳定性,GPPGPPGL具有较好的p H稳定性,GPAGPAGPR在p H 2~8时活性基本保持稳定,在p H 10~12时活性减弱。经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化处理后两种多肽活性基本保持稳定。通过MTT实验发现低浓度多肽对细胞均无明显抑制作用,多肽GPAGPAGPR和GPPGPPGL在不同浓度处理下的细胞生长形态与空白组相比均无明显差异。多肽能促进细胞释放舒张因子一氧化氮(NO)、抑制内源性收缩因子内皮素(ET-1),具有细胞水平上的降血压作用。
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