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第一部分:羟氯喹对树突状细胞功能的调控作用研究羟氯喹（Hydroxychloroquine,HCQ）是风湿免疫科常用的一种治疗SLE等自身免疫病的基础药物,具有毒副作用小,治疗效果较好的优势,并且被国内外的专家和机构推荐为治疗SLE的主要药物之一。但其具体的作用机制,仍未完全阐明。树突状细胞（Dendritic Cell,DC）,因其形态上的特征而得名,是功能最为强大的抗原提呈细胞,也是介导天然免疫与特异性免疫的重要桥梁。其通过细胞间直接接触和通过分泌细胞因子促进T细胞的增殖和分化,参与免疫应答,在多种疾病的发病中发挥重要的作用。Th17细胞,是一种新型的CD4+T细胞亚型,其在许多自身免疫病的发生发展中都起到了促进作用。HCQ作为自身免疫病治疗中应用的重要免疫调节剂,其对pDC和T,B细胞的直接影响已有报道,但HCQ通过影响DC分化和功能而间接影响T细胞应答目前尚未见报道。因此,本研究利用HCQ与DC细胞共培养,以空白处理为对照,研究HCQ对DC细胞的分化成熟的影响,并进一步研究HCQ处理对DC促进T细胞增殖和分化能力的影响,为HCQ治疗自身免疫疾病的生物学机制提供新的思路。目的:通过HCQ对小鼠骨髓细胞诱导的DC细胞分化成熟及其促T细胞增殖分化能力的影响及其机制的研究,探讨HCQ治疗自身免疫病的作用机制。方法:利用rmGM-CSF和rmIL-4细胞因子,诱导小鼠骨髓细胞分化成为DC细胞,同时加入HCQ一起培养。利用流式细胞术比较HCQ处理组DC细胞和HCQ未处理组DC细胞表面的MHC Ⅱ,CD40,CD80,CD86,PDL1,TLR2和TLR4分子的表达情况;利用ELISA的方法,检测HCQ处理组DC细胞和HCQ未处理组DC细胞分泌IL-1β,IL-6,IL-10,IL-23,TNF-α 和 TGF-β 细胞因子的能力;同时,利用 25Gy辐照过的DC与CD4+T细胞共培养,检测HCQ能否通过影响DC细胞表面分子的表达,影响其促T细胞的增殖和分化的能力;利用DC细胞上清与CD4+T细胞共培养,检测HCQ能否通过影响DC细胞分泌细胞因子,而影响其促T细胞的增殖和分化的能力;利用LPS刺激活化未成熟DC细胞,Western Blot技术检测HCQ处理组DC细胞和HCQ未处理组DC细胞内的p38和ERK1/2 MAPK激酶的磷酸化水平,随后利用p38和ERK1/2 MAPK激酶的抑制剂分别处理DC细胞,进而验证HCQ影响DC细胞的功能,是否可以归因于影响p38和ERK1/2 MAPK激酶通路。结果:①与HCQ未处理组DC细胞相比,HCQ处理组DC细胞表面的MHC Ⅱ,CD40和CD86分子的表达下降,有统计学差异;而CD80,PDL1,TLR2和TLR4分子的表达相似,无统计学差异;②与HCQ未处理组DC细胞相比,HCQ处理组DC细胞分泌IL-1β,IL-6,IL-23和TNF-α细胞因子的能力下降,有统计学差异;而IL-10和TGF-β分子的表达相似,无统计学差异;③与HCQ未处理组DC细胞相比,HCQ可以通过降低DC细胞表达分子的表达,进而引发其促CD4+T细胞增殖和促Th17细胞分化的能力下降,差异有统计学意义,而对其促Treg细胞分化的能力没有影响,差异无统计学意义;④与HCQ未处理组DC细胞相比,HCQ可以通过降低其分泌细胞因子的能力,进而引发其促Th17细胞分化的能力下降,差异有统计学意义,而对其促CD4+T细胞增殖和促Treg分化的能力没有影响,差异无统计学意义;⑤与HCQ未处理组DC细胞相比,HCQ处理组DC细胞的p38和ERK1/2 MAPK激酶的磷酸化水平下降;加入p38和ERK1/2 MAPK激酶的抑制剂后,HCQ处理组DC细胞和HCQ未处理组DC细胞之间,表面分子表达的差异、分泌细胞因子能力的差异和促Th17细胞分化能力方面的差异减小;HCQ抑制DC细胞的功能,可部分归因于抑制p38和ERK1/2 MAPK激酶通路。结论:HCQ能够抑制DC细胞的分化成熟,并且能够抑制其促CD4+T细胞增殖和促Th17细胞分化的能力,HCQ抑制DC细胞的功能,可部分归因于抑制p38和ERK1/2 MAPK激酶通路。第二部分:HCQ相关基因miRNA结合靶点内SNPs的生物信息学分析HCQ过去的一种抗疟疾的药物,目前已被广泛的应用于治疗自身免疫病当中。但是,服用HCQ药物的不同患者,会存在不同的临床表现,比如不同的血药浓度,不同的治疗效果或者不同的眼毒性等等。一些学者表明,这有可能与患者体内携带不同的单核苷酸多态性位点（Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs）有关。MicroRNA（miRNA）是一种非常重要的小的非编码RNA分子,它可以通过与其靶向mRNA分子的3’非编码区（3-Untranslated Region,3’UTR）进行结合,从而导致mRNA分子降解或者抑制其转录后的翻译。当其靶位点区域内存在SNPs位点时,则会影响miRNA的功能。因此,本研究利用生物信息学的方法,对HCQ相关基因miRNA靶点内的SNPs进行预测,希望能够为患者服用HCQ药物提供一些指导意见。目的:利用生物信息学的方法,对HCQ相关基因miRNA靶点内的SNPs进行预测,希望能够为患者服用HCQ药物提供一些指导意见。方法:首先,我们通过检索并查阅国内外HCQ相关的文献,检索HCQ相关的基因;利用dbSNP数据库,检索HCQ相关基因的SNPs位点,记录其3’UTR区的SNPs位点,同时仔细查阅,其在中国北京汉族人群中的最小等位基因频率（Minor allele frequency,MAF）,仅将 MAF>0.05 的 SNPs 位点记录下来;利用 miRNA靶标位点生物信息学预测数据库,预测前述SNPs位点是否存在于miRNA结合靶点区域内;随后利用RNAcofold数据库,预测不同SNPs的mRNA分子与miRNA的自由结合能,将其二者的差异定义为“△△G”,并利用其绝对值对miRNA进行排序;最后,我们利用Cytoscape 3.6.0软件,对MicroRNA和靶基因相互作用以及靶标SNP和其生物学作用进行了网络分析。结果:①经过检索相关文献,我们发现与HCQ相关的基因可以分为3类:第1类,与HCQ代谢相关的基因,包括CYP2C8、CYP2D6、CYP3A4和CYP3A5;第2类,与HCQ的治疗效果相关的基因,包括MTHFR,IL-10和TNF-α;第3类,与HCQ的眼毒性相关的基因,包括ABCA4;②通过利用5个不同的miRNA靶标位点生物信息学数据库的预测,最终发现,有4个基因的12个MAF>0.05的3’UTR区SNPs位点,处于 miRNA 靶点区域内,包括 CYP 2C8（rs1058932）,CYP 3A5（rs15524）,MTHFR（rs4846048,rs2184227,rs1537514,rs1537516,rs3737967,rs3820192,rs4846049,rs11559040 和 rs72640221）和 ABCA4（rs3747961）位点。结论:利用生物信息学预测的方法,可以得到HCQ相关基因miRNA靶点内的SNPs及与其结合的miRNA分子的信息;本研究所预测出的SNPs位点,可以为患者服用HCQ药物治疗自身免疫病时,提供理论指导。