论文部分内容阅读
在食品质量与安全得到有效管控下,虽然我国不合格食品比率处于较低水平,然而微生物所造成的食品安全仍是现今食品三大安全问题之一。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,以下简称“金葡菌”)是典型的食源性致病菌,其被膜形成能力强且致病性高。目前由于畜牧业中多耐药性金葡菌的层出不穷,因此可代替的杀菌方法不断受到重视,而通过调控细菌固有的程序性细胞死亡(Programmed cell death,PCD)系统是潜在的杀菌途径之一。而近年来发现在群体微生物中铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,以下简称“铜绿菌”)所形成的胁迫压力能够调节金葡菌PCD系统,同时显著抑制金葡菌的生长甚至能够完全杀死金葡菌。因此,针对金葡菌固有PCD系统,探究群体微生物被膜中金葡菌PCD调控机理,为防止和清除食品中金葡菌污染提供重要理论基础。1.构建不同增殖特性的菌落群体生物被膜模型,对不同时期群体生物被膜中的铜绿菌与金葡菌进行RNA-seq测序。转录组结果表明在群体生物被膜形成过程中,两株铜绿菌(ATCC27852和HQ)显著调控金葡菌10071的能量代谢、氨基酸代谢、核酸代谢、金属离子摄取、压力应答以及PCD系统。而两株铜绿菌也会调节自身的能量代谢以及铁离子摄取。在能量代谢层面上,两株铜绿菌抑制金葡菌有氧呼吸且铜绿菌ATCC27853抑制作用更强,因此金葡菌以无氧呼吸和无氧发酵为主,积累氨以及弱酸。而两株铜绿菌除了进行有氧呼吸,还通过代谢金葡菌分泌的乳酸来获取能量。在铁离子摄取层面上,在群体生物被膜中铜绿菌ATCC27853会与金葡菌分享铁离子,而铜绿菌HQ则与金葡菌竞争铁离子,铁离子限制促进了金葡菌被膜生成能力,从而使其与铜绿菌HQ长期共存。对于金葡菌PCD系统来说,在整个生物被膜形成过程中铜绿菌ATCC27853通过诱导抑穿孔素蛋白抑制细胞自溶,使破坏其生物被膜固有结构,同时激活cid C介导的PCD刺痛。而铜绿菌HQ虽然激活了cid C介导的PCD系统却没有诱导抑穿孔素蛋白。2.构建有氧呼吸、无氧呼吸以及无氧发酵代谢模型并应用于铜绿菌与金葡菌共培养,结果表明在不同的代谢状态(有氧呼吸、无氧呼吸以及无氧发酵)下,三株铜绿菌(PAO1,ATCC27853,HQ)均能诱导处于稳定生长期的金葡菌10071出现细胞死亡。在有氧呼吸状态下,培养24 h后铜绿菌PAO1和ATCC27853能够使金葡菌的可培养数下降至0,而铜绿菌HQ能够与金葡菌10071共存5 d。而在无氧呼吸和无氧发酵状态下金葡菌10071能够与三株铜绿菌共存生长5 d。不同的金葡菌(110749和121931)与铜绿菌ATCC27853和HQ的共培养结果与金葡菌10071类似。在所有铜绿菌与金葡菌10071共存的组别中,SCVs占总可培养细胞的比率均处于80%以上。同时三株铜绿菌诱导的金葡菌10071的SCVs稳定性较差,在新鲜培养基中培养6 h后其菌落大小均能够恢复至于正常细胞菌落一样。3.有氧和无氧呼吸的铜绿菌上清液除了抑制金葡菌前期生长,还能诱导稳定期细胞死亡,根据下降幅度各代谢状态铜绿菌上清液作用效力如下:有氧>无氧>发酵;而在铜绿菌上清液中金葡菌10071从有氧呼吸向无氧呼吸或发酵生长转变是提高其存活率的方式之一。随着p H从中性(p H=7)到碱性(p H=9)的改变,所有铜绿菌有氧呼吸上清液对金葡菌10071有氧呼吸生长的抑制作用不断减弱,然而对金葡菌10071无氧呼吸或发酵生长没有显著影响,初步推断铜绿菌有氧呼吸上清液能够通过抑制金葡菌10071有氧呼吸来激活cid C介导的PCD系统,从而积累弱酸并导致细胞死亡;与无氧呼吸或发酵相比,在有氧共培养中铜绿菌ATCC27853能够显著诱导金葡菌10071两种PCD系统的上调(cid C和lrg AB),而铜绿菌HQ仅在有氧呼吸培养前期(24 h)激活金葡菌10071两种PCD系统。这进一步从分子层面上确认铜绿菌ATCC27853通过抑制金葡菌10071有氧呼吸进而激活PCD系统。