论文部分内容阅读
苯胺是一种危害性极大的污染物,对人体有致癌作用.利用微生物降解这类化合物受到全世界各国的重视.本实验中前期研究中,从印染厂活性污泥中分离到的一株能高效降解苯胺的丛毛单胞菌Delftia tsuruhatensis.AD9,克隆了完整的苯胺降解基因簇,其中包含两个赖氨酸型调控基因和有两个编码邻苯二酚2,3-双加氧酶(C23Os)的基因(tadC1、tadC2),分别位于苯胺降解基因簇的两个操纵子上.C230是芳香族化合物生物降解过程中重要的一个关键酶.本研究对Delftia tsuruhatensis AD9中苯胺降解基因簇中tadC1、tadC2的基因序列分析及Blast比对,发现在核苷酸水平上tadC1与tadC2的同源性仅有55﹪,对两个基因推导的氨基酸序列分析表明TadCl与TadC2的同源性仅有50.47﹪.但是,预测两个酶的蛋白三维结构却惊奇的相似.
首先我们测定了Deoftia tsuruhatensis AD9的对苯胺和邻苯二酚耐受性,发现AD9对邻苯二酚的耐受性远远低于对苯胺的耐受性.AD9菌株能耐受苯胺的浓度达4500mg/l,相比对邻苯二酚的耐受浓度低于600mg/1,超过该浓度时,AD9菌株的生长完全被抑制.同时,也发现在苯胺降解初期,伴随着2一羟粘糠酸半醛(HMS)的积累.表明TadCl和TadC2在苯胺经苯胺双加氧酶的催化转化成邻苯二酚后,邻苯二酚2,3一双加氧酶对中间产物的进一步降解起到重要作用.
为了分析AD9菌中两种邻苯二酚2,3-双加氧酶TadCl和TadC2的作用,我们利用RT-PCR技术在转录水平上分析tadC1雨JtadC2的表达情况,实验结果表明tadC1和tadC2两个基因的表达分别受苯胺和邻苯二酚的诱导.在苯胺诱导物存在下,tadC2的表达量明显低于tadC1的表达量.为了进一步分析tadC1和tadC2编码的C230的功能,本研究分别克隆tadC1和tadC2基因,并构建原核蛋白表达载体pet28a上,获得两个基因的表达菌株pETC1和pETC2.对提取的TadC1和TadC2粗酶进行了酶活测定,发现TadC1酶粗提液对邻苯二酚的降解速率明显高于TadC2酶粗提液.从上述实验结果中,我们推测tadCJ编码的邻苯二酚2,3～双加氧酶在苯胺降解中起主要作用,而由tadC2编码的C230可能在在苯胺降解过程中起着补偿机制的作用.