背景和目的：血栓形成或血栓栓塞是导致心、脑和外周血管事件的最后关键环节,是致死和致残的直接原因。以心肌梗死、脑卒中为代表的血栓栓塞性疾病导致的死亡已占到全球总死亡人数的一半以上,远远超过肿瘤、传染性疾病、呼吸系统疾病等造成的死亡,其中很大一部分原因是由于血栓不能早期检出而延误治疗。超声是一种被广泛应用于临床的影像检测手段,对四肢动、静脉血栓的诊断与随访观察具有重要的临床意义,但由于早期血栓的回声与血液的回声基本相似,并且对于超声医师的经验水平要求较高,因此,超声对早期血栓的检出率及准确性受到明显限制,则有赖于有创的动、静脉造影或昂贵的CT、MRI检测。因此,如果能够发展一种技术检测手段,能够早期无创、敏感而特异性的诊断血栓进而早期治疗血栓,这对于降低患者的死亡率及并发症的发生率具有非常重要的临床价值。近年来,随着靶向超声微泡造影剂的出现,靶向超声分子显像(targeted ultrasound molecular imaging)逐渐成为现实,极大的拓展了传统超声微泡的应用范围,使应用超声技术从分子水平对各种疾病进行早期诊断成为可能,被誉为超声医学发展史上的“第三次革命”。目前,国际上已经有一些实验室应用靶向超声分子显像技术成功对动物深静脉、心房血栓等进行了评价,然而由于动脉血流的高剪切应力,实现动脉血栓的靶向超声分子显像、需要制备出靶向结合能力更强的微泡,而国内应用高效价靶向微泡评价动脉血栓形成的报道几乎空白,相关研究基本还没有实质性进展。血栓形成部分原因有赖于血小板的活化、聚集,活化的血小板表面高表达血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受体,其与纤维蛋白原等物质中的精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(RGD)结合位点结合,促进血小板的聚集和早期血栓的形成。如果在微泡表面装配上能高效能的主动趋向血小板GPⅡb/Ⅲa受体的配体,那么微泡将可以通过配体-受体的作用结合在一起,这样微泡就与血栓中的活化血小板特异性牢固结合从而实现血栓的早期靶向分子成像。以往研究中将含RGD序列的线性寡肽连接在普通微泡外壳构建靶向血栓微泡,结合对比超声成功应用于深静脉、心房血栓的靶向成像,研究发现人工合成的RGD环寡肽序列能够模拟体内的天然RGD结合位点,比含RGD序列的线性寡肽具有更强的结合血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受体的能力,因此,如果将人工合成的RGD环寡肽序列装配在普通微泡表面,则具有更强的靶向结合血栓能力,将有望实现动脉血栓的早期靶向超声分子显像。因此,本研究在普通脂质微泡的基础上,在其外壳通过共价连接的方式连接上能够和活化血小板高表达的GPⅡb/Ⅲa受体特异、高效结合的RGD(Arg-Gly-Asp)环寡肽序列从而制备血栓靶向超声微泡(MBRGD),应用平行板流动腔评价其与糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受体的亲和力及黏附能力,并在体外琼脂糖流动腔模型及体内大鼠腹主动脉血栓模型上,应用MBRGD和对比超声(CEU)检查相结合,分别对体外制备的血栓以及大鼠腹主动脉血栓进行靶向超声显像,目的在于探讨MBRGD结合CEU评价动脉血栓形成的可行性。材料和方法：1.超声微泡的制备及理化性质鉴定各种相关脂质材料与人工合成的磷脂环五肽或与其分子量相当、结构相似的同型非特异性多肽按一定质量比例75℃水浴溶解于适量蒸馏水中,同时通全氟丙烷(C3F8)气体,超声振荡至形成乳白色液体制备靶向超声脂质微泡(MBRGD)和同型对照非靶向微泡(MBCON),MBRGD及MBCON经静置弃下清液并加入等量蒸馏水去除未结合脂质纯化2次。制备及纯化后的MBRGD、MBCON均于冰箱中4℃保存备用。采用库尔特计数仪检测微泡的粒径分布及浓度。2、平行板流动腔体外评价MBRGD与血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)的靶向黏附效能2.1、结合实验：MBRGD和MBCON (5×106/ml)各分成3组(每组n=3),经微量注射泵分别以0.6dyn/cm2、1.8 dyn/cm2和3.6dyn/cm2的剪切应力通过血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa包被(1000ng/ml)的平行板流动腔；自显微镜下观察到有微泡出现后开始连续录像6min,观察第6分钟后微泡的结合情况；各组分别以“糖蛋白GPⅡb/Ⅲa包被(1000ng/ml)+大量RGDfvV (Blocker组,n=3)”和"0ng/ml糖蛋白GPⅡb/Ⅲa包被(空白组,n=3)”为对照。2.2、解离实验：平行板流动腔以(1000ng/ml)糖蛋白GPⅡb/Ⅲa包被,流动腔内注入5×106/ml或MBCON约0.2ml后静置5分钟,先以0.9%生理盐水(极低剪切应力0.2dyn/cm2条件下)冲洗掉静止但未结合的微泡,待镜下无游离的微泡后,每30s逐渐增加剪切应力,直至微泡完全解离。20倍物镜在固定的视野下全程录像、拍照。3.应用琼脂糖流动腔模型体外评价MBRGD靶向血栓效能自制琼脂糖流动腔模型,将制备的MBRGD和同型对照微泡(MBCON)随机注入自制琼脂糖流动腔模型内,与体外制备的新鲜血栓孵育30 min后,PBS液15 cm/s流速不间断冲洗血栓,分别在冲洗血栓2、4、6、8、10 min时行对比超声检查并测量血栓声强度(Ⅵ)值。4.大鼠动脉血栓形成模型的制备及分组8只实验大鼠常规麻醉后,将大鼠仰卧位固定四肢于鼠板上,颈静脉插管用于注射微泡。经腹部正中线位置开口,钝性分离皮下肌肉,暴露腹主动脉、右侧髂总动脉和下腔静脉,用棉签轻轻将腹主动脉和下腔静脉下端分离。用动脉夹暂时夹闭腹主动脉,将右侧髂总动脉远端用细线结扎,在其近端血管下穿一根细线,然后在结扎部位近端行动脉插管,紧接着将事先置放于聚乙烯管中的细棉线(该棉线已浸泡过凝血酶)通过钢丝推送入腹主动脉部位,拔出钢丝和聚乙烯管,将右侧髂总动脉结扎,遂松开腹主动脉处的动脉夹开放腹主动脉血流,一小时后可在棉线表面形成不完全阻断血流血栓。二维超声可见血栓内部的棉线影确定血栓形成的位置。8只制备腹主动脉血栓模型的大鼠先后随机注入MBRGD和MBCON后行CEU检查,并根据注入超声微泡的不同分为MBRGD组和MBCON组。5.大鼠腹主动脉CEU检查及图像分析：动物模型制备后,用支架固定超声探头(17L5)于大鼠腹主动脉棉线置入部位上方,调整探头位获得良好的腹主动脉长轴切面后保持探头位置在整个实验过程中不变,仪器的各项参数在整个实验过程中不变。CEU检查采用二次谐波成像(second harmonic imaging)技术进行,探头发射和接收频率分别为7.0 MHz和14MHz,机械指数(Mechanical Index,MI)为0.18,超声发射间隔(Pulsing Interval, PI)时间设定为10s,靶向超声成像：每只大鼠采用微量进样器经颈静脉随机(间隔30min)先后注射MBCON和MBRGD的数量约为10×106个。在注入微泡10min后行CEU,获取第一帧图像后给予高MI的连续超声发射2-3s以破坏微泡,继续存储本底图像2-3帧,全部声学造影图像存于CD盘,以备脱机分析。第一帧图像声强度(Ⅵ,视频密度)可代表靶向微泡在腹主动脉的总浓度,包括粘附血栓浓度和循环微泡。微泡破坏后存储图像上的Ⅵ反应的是在血池中循环微泡的浓度。前者减去后者得到的是粘附血栓的微泡浓度。取图结束后,应用CEU图像分析软件对图像进行分析,测量大鼠腹主动脉血栓造影的Ⅵ值,并用彩色编码技术制作动脉血栓显影的彩色编码图像,采用红色、橙色和蓝色依次代表血栓显影的强度由强到弱。6.病理学检查：图像采集完成后,取出大鼠腹主动脉迅速做冷冻切片,行病理学检查及免疫组化检查。结果：1、超声微泡制备情况：采用声振法制备的MBRGD-MBCON在显微镜下观察均为透亮微气泡,大小形态一致,采用库尔特计数仪测得MBRGD平均粒径2.13±1.18gm,浓度约为3.18-5.26×108个/ml;MBCON平均粒径2.18±1.11μm,浓度约为3.02-5.18×108个/ml。2、平行板流动腔法评价MBRGD的制备效果2.1、平行板流动腔结合实验显示在一定剪切应力作用下(0.6-3.6 dyn/cm2) MBRGD与血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa包被的平行板流动腔具有很好的靶向粘附效能,而封闭组和空白对照组中MBRGD几乎不能与与血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa包被的平行板流动腔结合,而MBCON不论在Blocker组、空白对照组还是GPⅡb/Ⅲa包被组均不能与平行板流动腔结合。2.2、随着剪切应力的不断增加,可见MBRGD能够抵抗一定血流剪切应力的冲刷,MBRGD半数解离时剪切应力已达到(25.54±1.27)dyn/cm2,且微泡完全解离时剪切应力已高达(95.63±1.78)dyn/cm2,而MBCON半数解离时及完全解离时剪切应力仅有(4.46±0.09 dyn/cm2,P<0.05 vs MBRGD)和(27.29±0.74 dyn/cm2,P<0.05 vs MBRGD).3.体外琼脂糖流动腔中血栓CEU显影图像及Ⅵ分析第一帧CEU图像(A1)显示血栓与MBRGD孵育后经PBS液冲洗2min后可见显著的超声显影,而与MBCON孵育后经PBS液冲洗2mmin后仅见轻度的超声显影(A2),其显影强度较前者明显减弱。并且,MBRGD组在经PBS液冲洗4、6、8、10 min后的血栓超声显影均明显较对照MBCON组强。未经PBS冲洗前时两组微泡之间声强度值比较无差异(t=-0.119,P=0.907),2、4、6、8、10min时血栓声强度值MBRGD组均高于MBCON组(t2min=13.488,t4min=8.234,t6min=7.880,t8min=10.079, t10min=10.842,所有P=0.000)；不同时间水平比较有显著差异(F=136.244,P=0.000),主要表现为Ⅵ值随冲洗时间呈下降趋势,MBCON下降幅度较MBRGD大。4.腹主动脉血栓CEU检查结果及Ⅵ分析MBRGD组的第一帧CEU图像显示MBRGD明显增强腹主动脉血栓的显影,显影增强主要在血栓的近端较为显著；而MBCON组显示MBCON不能使增强血栓显影。对比超声Ⅵ分析：血栓Ⅵ值在MBRGD组和MBCON组分别为18.84±3.06和5.99±1.18,MBRGD组缺血栓Ⅵ值约为MBcON组的3.15倍,两者之间有显著性差异(P<0.05)。5.病理学检查：将一部分腹主动脉解剖开,肉眼可见在棉线置入处形成动脉血栓,HE及免疫组化结果显示：血栓结构中可见大量血小板小梁形成、并且血栓大量表达GPⅡb/Ⅲa受体,证实为腹主动脉富含血小板血栓形成。结论：1.平行板流行腔实验证实采用共价连接的方法可成功构建携带环寡肽RGD序列的血栓靶向超声微泡(MBRGD),并且靶向微泡具有较强的主动结合靶分子及抵抗较高剪切应力冲刷的能力。2.体外琼脂糖流动腔实验表明MBRGD具有较好的靶向结合血栓效能,靶向血栓黏附后能抵抗一定的剪切应力,具有较好的靶向血栓分子显像的效果。体外模拟体内剪切应力血流环境评价MBRGD的靶向血栓分子成像效果将有助于预测MBRGD应用于体内血栓超声分子成像的效果。3.应用携RGD环寡肽序列的靶向超声微泡行大鼠腹主动脉血栓对比超声检查产生的“主动性靶向超声分子成像”可有效评价大鼠腹主动脉血栓形成,将有助于血栓形成的早期诊断、靶向带药溶栓治疗及疗效的监测等。