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本研究以脂质体药物的包封率、稳定性为评价指标,通过单因素考察和正交设计法筛选干扰素脂质体的最佳处方;采用优化处方及工艺制备干扰素脂质体混悬液,选用适当基质为赋形剂,研制使用方便、稳定高效的干扰素脂质体凝胶剂;考察制剂的理化性质、稳定性及皮肤刺激性;考察干扰素脂质体凝胶的体外和体内透皮扩散情况,并与临床应用的干扰素凝胶剂进行比较,探讨脂质体对药物透皮扩散的影响;建立皮肤单纯疱疹病毒感染的豚鼠模型,进行初步的药物抗病毒试验,探讨干扰素脂质体凝胶剂的药效。
方法:
1制备干扰素脂质体混悬液选用薄膜超声法、薄膜+高压匀化法分别制备干扰素脂质体,比较其制备工艺和制备质量的差异。通过单因素考察,确定对干扰素脂质体包封率和稳定性影响较大的因素,结合正交试验设计,筛选干扰素脂质体的优化处方,制备干扰素脂质体混悬液。采用凝胶柱过滤法和超滤膜过滤法分离、纯化脂质体,ELISA法测定干扰素含量,比较两种分离方法对脂质体包封率检测的影响。
2 制备干扰素脂质体凝胶剂并考察其理化性质以干扰素在离体大鼠皮肤中的滞留量为考察指标,选用不同浓度的卡波姆为凝胶基质,确定其配方并制备干扰素脂质体凝胶剂;研究干扰素脂质体凝胶剂在离心试验、光照试验、温度影响试验、湿度影响试验等条件下,制剂性状、药物含量等各项理化指标的变化,初步考察其稳定性。
3 干扰素脂质体凝胶剂的透皮试验以SD大鼠为试验对象,进行离体及在体皮肤透皮试验,考察干扰素脂质体凝胶剂的透皮效果。
4 干扰素脂质体凝胶剂的皮肤刺激性试验以家兔为试验对象,在其背部皮肤分别涂抹干扰素脂质体凝胶和干扰素凝胶,并于用药后12、24、48、72h分别观察皮肤变化情况,研究干扰素脂质体凝胶剂对家兔皮肤的刺激性。
5 干扰素脂质体凝胶剂的抗病毒试验以Vero细胞为繁殖细胞,在37℃、5%CO<,2>孵箱中进行单纯疱疹病毒的增殖;采用空斑形成试验,测定单纯疱疹病毒的滴度;以白色雄性豚鼠为试验对象,制备皮肤单纯疱疹病毒感染的豚鼠模型,于第3天开始,分别给予干扰素脂质体凝胶剂和市售干扰素凝胶进行治疗,观察试验区皮肤的症状,比较病变的痊愈时间及累积计分,考察干扰素脂质体凝胶的药效。
结果:
1干扰素脂质体混悬液的制备采用薄膜超声法制备的干扰素脂质体混悬液在室温和4℃冰箱放置1个月后,有凝聚、分层现象;而用薄膜+高压匀化法制备的干扰素脂质体在放置1个月后,仍呈均匀、半透明的乳白色溶液状态,表现出较好的制剂稳定性。采用薄膜+高压匀化法制备脂质体,在单因素考察的基础上,确定磷脂与胆固醇比例、干扰素用量、水化溶液用量与十八胺用量等四个因素,每个因素各设三个水平,正交设计试验结果显示,各因素对包封率影响的大小顺序为:十八胺用量一水化溶液用量一磷脂与胆固醇比例一干扰素用量。最后确定干扰素脂质体的优化处方组合为磷脂:胆固醇4:1,干扰素300万U,十八胺60 mg,PBS 60 ml。
采用凝胶柱过滤法与超滤膜过滤法分离纯化脂质体,测得的药物包封率基本无差别。电子显微镜观察,优化处方制备的脂质体呈球形或类圆形,大小均一,表面光滑、规整,分散性良好。采用凝胶柱过滤结合ELISA法测定干扰素脂质体,平均包封率为64.64%,激光散射粒度分析仪测定平均粒径为107 nm,表面Zeta电位平均>25 mv。分别于制备后1周、1个月、3个月后取样观察,存放于4℃冰箱中的脂质体无分层、沉淀及颜色变化,其粒径和包封率变化很小(P>0.05),而存放于室温下的脂质体3个月后发现有少量白色沉淀,且粒径和包封率变化较大(P<0.01)。
2 干扰素脂质体凝胶剂的制备分别制备含0.5%、1.0%、1.5%卡波姆的干扰素脂质体凝胶,凝胶外观呈乳白色,胶体细腻、均匀,pH值为6.0~6.5。稳定性试验表明,光照和湿度变化对凝胶的质量稳定性影响较小,而温度变化对其影响较大。离体大鼠皮肤试验结果表明,含0.5%卡波姆的干扰素脂质体凝胶在皮肤中的干扰素滞留量最多。
3 干扰素脂质体凝胶剂的大鼠皮肤渗透试验以市售的干扰素凝胶为对照,离体和在体大鼠皮肤透皮试验结果均显示,使用本研究制备的干扰素脂质体凝胶剂,干扰素在皮肤中的滞留量明显高于对照组(P<0.01)。
4 干扰素脂质体凝胶剂的皮肤刺激性试验家兔在体皮肤刺激性试验表明,使用干扰素脂质体凝胶剂和市售的干扰素凝胶,家兔背部皮肤均未出现红斑、水肿等现象,表明制备的干扰素脂质体凝胶剂对皮肤无刺激性。
5 干扰素脂质体凝胶剂的抗单纯疱疹病毒试验单纯疱疹病毒(HSV-1)感染Vero细胞后很快增殖,用超低温反复冻融法收获病毒,采用空斑单位形成试验测定病毒上清液的滴度为1.5×10<7>PFU/ml。豚鼠感染病毒后第2天可见皮肤红肿现象,第3天出现1~2个小疱疹,第4天病变发展至高峰。比较4组豚鼠皮肤的病变积分和痊愈时间,干扰素脂质体凝胶组和干扰素凝胶组病变积分均小于病毒感染组和基质对照组,病毒感染的痊愈时间大大缩短,差异有统计学意义(p<0.01)。干扰素脂质体凝胶组与干扰素凝胶组相比,病变积分小,痊愈时间短,疗效有显著性差异(p<0.01)。
结论:
采用薄膜+高压匀化法能够成功地制备干扰素脂质体,用优化处方制备的干扰素脂质体包封率较高、粒径小、均匀性和稳定性好。干扰素在较低浓度的卡波姆基质中容易得到释放,含0.5%卡波姆的干扰素脂质体凝胶剂在大鼠单位面积皮肤中干扰素滞留量最多。
离体和在体大鼠皮肤透皮试验显示,干扰素脂质体凝胶剂能表现出优于市售干扰素凝胶的皮肤渗透特点,有利于干扰素在皮肤中的聚集和发挥抗病毒作用。
抗单纯疱疹病毒试验初步证明,干扰素脂质体凝胶制剂能有效地发挥抗单纯疱疹病毒的作用。