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目的:目前,针对白血病的靶向治疗包括以细胞特异性表达分子为靶点的抗体药物和抑制剂药物等。白血病发病机制复杂,存在着异质性,并且常常导致药物耐药。因此,需要研发出新的具有抗白血病潜能的药物。ASPNJ是本课题组从日本刺沙蚕体内提纯的酸性丝氨酸蛋白酶,同时具有蛋白水解酶活性和纤溶酶活性。我们前期工作发现,ASPNJ能够诱导髓细胞白血病细胞(K562细胞,NB4细胞)凋亡,抑制白血病细胞增殖。进一步的实验发现其作用位点可能是细胞膜上某些特定蛋白质,通过对这些蛋白质的降解作用及相应信号转导通路的变化,使细胞发生凋亡和死亡。本实验研究ASPNJ抗急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞的作用,并从膜相关蛋白质组学方面研究其作用早期的可能机制,为进一步阐明白血病的致病机制,研究白血病的治疗提供新的思路。方法:1、MTT比色法检测不同浓度的ASPNJ对不同细胞系(Raji,U937,Jurkat,4T1,Smmc7721及293T)细胞的增殖抑制作用;2、纤维平板法检测ASPNJ酶活性与其对Jurkat细胞增殖抑制作用的关系;3、台盼兰染色检测ASPNJ对Jurkat细胞生长的影响;4、瑞氏-吉姆萨染色观察ASPNJ作用于Jurkat细胞形态学的变化;5、流式细胞术检测ASPNJ对Jurkat细胞凋亡的影响;6、MTT法检测ASPNJ对长春新碱作用于Jurkat细胞增殖抑制作用的影响;7、提纯细胞膜蛋白,双向电泳对低剂量短时间药物(ASPNJ 4μg/m L,3h)处理前后细胞膜蛋白进行分离;8、采用质谱法分析膜蛋白差异点并鉴定ASPNJ对Jurkat细胞作用早期的靶蛋白;9、选取三种差异表达明显的蛋白进行Western blot和RT-PCR检测验证。结果:1、MTT法检测结果表明,相对4T1,Smmc7721和293T细胞,ASPNJ处理的Raji,U937和Jurkat细胞增殖明显下降。因此,白血病细胞对ASPNJ更敏感。台盼兰染色法结果也表明,ASPNJ对Jurkat细胞有明显的生长抑制作用,并呈现出时效-量效关系。2、通过纤维蛋白平板法检测表明,细胞培养上清液中纤溶酶活性随着ASPNJ剂量增大而增大,随着作用时间增加而降低。MTT法检测结果表明,相对有活性的ASPNJ,热变性和用PMSF抑制活性的ASPNJ对Jurkat细胞增殖抑制作用明显降低。这说明ASPNJ的酶活性是抑制Jurkat细胞增殖必不可少的条件;但是,ASPNJ对细胞增殖的抑制作用随时间增加,而其细胞培养上清液中纤溶酶活性随时间降低,这说明ASPNJ对细胞增殖的抑制作用除了酶活性的直接作用还存在其它间接作用机制。3、瑞氏-吉姆萨染色结果表明,ASPNJ作用后有些细胞呈现膜破裂,有些细胞发生染色质浓缩和核固缩等细胞凋亡形态学变化,且随着药物作用时间增加而更加明显;流式细胞术检测到ASPNJ对Jurkat细胞有明显的诱导凋亡作用,且呈现时效-量效关系。4、ASPNJ具有增加Jurkat细胞对长春新碱敏感性的作用,随着ASPNJ剂量的增加和作用时间的延长,联合用药对细胞的增殖抑制作用更强烈。5、2DE-质谱分析得到44个蛋白差异点(对照组升高有34个,加药组升高有10个);经过质谱分析及数据库比对结果得到7个差异蛋白质点(1-5在对照组升高,6-7在加药组升高),具体信息如下:1)SBP1(Selenium-bingding protein)通过改变脂质/葡萄糖代谢信号通路,发挥抑制肿瘤细胞的生长和转移的作用[1]。2)SUMF2(Sulfatase-modifying factor 2)可与IL-13和IL-13受体相互作用,并抑制IL-13分泌[2]。3)PRDX6(Peroxiredoxin 6)同时具有GPx和i PLA2的活性,促进肿瘤发生发展。PRDX6下调可增加肿瘤细胞对放疗和化疗的敏感性,并通过iPLA2活性导致细胞周期阻滞和细胞凋亡[3]。4)CHP1(Calcium-binding protein)具有调节低氧诱导因子(HIF-1α)活性的作用[4],从而参与促进肿瘤血管生成。5)SAR1A(GTP-binding protein SAR1a)参与蛋白质从内质网到高尔基体的运输[5]。6)PGRC1(Mebrane-associated progesterone receptor component 1)是膜相关的孕激素受体,通过阻断线粒体相关的凋亡途径起到对神经元的保护作用[6]。7)RSSA(40S ribosomal protein SA)是参与40S核糖体组装和稳定的蛋白质,同时也是主要存在于细胞膜表面的层粘连蛋白受体,参与细胞与基底膜的粘附和信号转导通路的激活[7]。在许多癌细胞中过表达[8-10]。6、选取PRDX6,CHP1和RSSA这三个差异蛋白质点进行了Western Blot和RT-PCR验证。其中,三种蛋白质的膜蛋白表达水平与2DE-质谱分析结果一致,而其m RNA水平表达和总蛋白表达水平不尽相同。结论:白血病细胞对ASPNJ更敏感,ASPNJ对Jurkat细胞的增殖和生长有明显抑制作用,并呈现出时效-量效关系,ASPNJ酶活性是其抑制Jurkat细胞增殖和生长必不可少的条件。但ASPNJ对Jurkat细胞的增殖和生长还存在其它间接抑制作用。ASPNJ对Jurkat同时具有使细胞坏死和促进细胞凋亡的作用。ASPNJ与长春新碱干扰蛋白质合成、抑制细胞有丝分裂的作用机制完全不同,可以增强长春新碱的作用效果,减少化疗药物的剂量并减轻其毒副作用。ASPNJ给药前后的细胞膜蛋白2DE-质谱分析,得到7个差异表达蛋白为SBP1,SUMF2,PRDX6,CHP1,SARIA,PGRC,RSSA。其中,PRDX6,CHP1和RSSA在膜蛋白质表达水平得到验证。我们推测ASPNJ对Jurkat细胞增殖和生长抑制作用的间接机制,可能与这几种差异表达蛋白相关。因此,ASPNJ对白血病细胞的作用与机制的研究为抗白血病研究提供新的生物标记蛋白,并可能为白血病的治疗提供新的途径,值得进一步的研究。