海洋放线菌可产生多种结构新颖、功能多样的活性物质,是天然活性产物和新药开发的重要来源,因此日益受到人们的关注。卤化酶修饰对多种天然产物的生理学活性具有重要影响,因此基于卤化酶的基因筛选有助于快速发现新的卤化抗生素,对新型卤化酶的催化机制进行研究,有助于利用卤化酶进行活性物质的修饰,提高化合物活性。本课题利用基于卤化酶的基因筛选,从海洋放线菌菌种文库中获得了四株阳性菌株,编号分别为L131、S077、S104和S187。其中菌株L131和S077的卤化酶片段氨基酸序列与万古霉素生物合成基因簇中的卤化酶相似性最高(71%),对这两株菌株的抗菌活性进行研究,发现两株菌株都可产生抗真菌活性物质,对白色念珠菌和番茄叶霉菌具有良好的拮抗活性。16S rRNA分析结果显示,菌株L131与灰白链霉菌(Streptomyces canescens)同源性最高(99%),但其与灰白链霉菌在形态和生理生化特征方面存在一定差异。L131在Bennett培养基上生长良好,菌落边缘褶皱,孢子为白色,基内产淡黄色色素,不能够利用阿拉伯糖和果糖作为菌种惟一碳源,且NaCl浓度的耐受范围为0-110g/L, pH值的耐受范围为7-11,可能与其更强的海洋环境适应能力有关。通过培养基优化确定了最佳液体发酵培养基(玉米粉15.0g/L,大豆粉15.0g/L,酵母浸粉15g/L, CaCO30.5g/L,甘油0.2%,pH自然),在该培养基培养72h,发酵液具有较好抑制白色念珠菌活性,且活性物质能够在pH5-10的范围内稳定,同时比乙酸乙酯极性大。进一步提出了活性物质粗提物的纯化路线：使用AB-8大孔吸附树脂吸附离心后的L131发酵液上清,使用40%甲醇去除未被吸附物质,再使用100%甲醇洗脱活性物质,粗提物对白色念珠菌和番茄叶霉菌的最小抑菌浓度均为32.0μg/mL,同时该活性物质能够造成番茄叶霉菌细胞膜、孢子损伤和ROS的大量积累。对星海链霉菌S187(Streptomyces xinghaiensis)的卤化酶SinH功能进行了深入研究,氨基酸序列分析显示,其与替考拉宁生物合成基因簇的卤化酶StaI和StaK相似性最高(87%)。为获得可溶的卤化酶,在大肠杆菌(Escherichia coli) DE3中进行了SinH的体外异源表达,研究了蛋白可溶表达的条件。pET28a表达载体得到的为不可溶卤化酶蛋白,因此构建带有融合标签泛素和自剪切内含肽的pHUIE-sinH表达载体,诱导获得了可溶的目标蛋白,并分离纯化获得目标蛋白SinH,但纯度较低。构建含有链霉菌分子伴侣的共表达体系BL21/pET28a-sinH/pETcoco-pL1SL2,诱导获得可溶目标蛋白,使用Ni-NTA亲和层析分离纯化获得目标蛋白SinH,构建pET28a-fre表达载体,并诱导表达分离纯化获得目标蛋白黄素还原酶Fre。利用L-Tyr、D-TyrL-Trp、D-Trp、4-hydroxy-D-phenylglycine作为底物对卤化酶SinH进行酶活检测均未检测到酶活,推断SinH的底物不是游离氨基酸,其作用于生物合成稍后的步骤。进一步利用基因破坏对卤化酶SinH的功能进行研究,使用λ-Red以及结合转移的方法,获得了sinH的破坏子ΔsinH,破坏子的抗补体活性与野生型在4d基本一致,在6d、8d时高于野生型,同时,ΔsinH破坏子发酵液具有更强的抑制金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌的活性,推断产生的脱卤类似物具有更强的抗菌活性,与以往的报道中卤化提高化合物活性的结论不一致。通过HPLC分析发现野生型S187的出峰时间为7.842min的物质与卤化酶的出峰时间为7.356min的物质选波长吸收波形基本一致,同时后者的最大吸收波长比前者要偏短,推断野生型S187的出峰时间为7.842min的物质可能是活性物质峰,卤化酶破坏子的出峰时间为7.356min的物质可能为去卤化活性物质峰。本文的研究为进一步开发利用海洋放线菌生产抗菌药物奠定了基础,同时,对星海链霉菌卤化酶的功能分析为进一步研究星海链霉菌生物活性物质的生物合成分子机制提供了信息。