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目的日本血吸虫病是一种由日本血吸虫(Sj)感染引起的的慢性寄生虫病,主要流行于印尼、中国、菲律宾等亚洲国家和地区,是我国重点防治的公共卫生问题之一。多年来我国防控血吸虫病主要利用药物治疗、灭螺、健康教育以及环境改造等综合措施,并且取得了显著的成就。但是这些措施不能完全消灭血吸虫病,研制疫苗成为防控该病的重要战略措施。本实验利用Sj谷胱甘肽-S-转移酶(Sj26GST)和信号转导蛋白(Sj14-3-3)两种抗原分子的编码基因进行拼接,并以两歧双歧杆菌(Bb)为载体,构建日本血吸虫重组Bb(p GEX-Sj26GST-Sj14-3-3)疫苗,研究该融合基因在两歧双歧杆菌中的表达效率,为下一步疫苗免疫机制的研究打下基础。方法以本室构建并保存的重组质粒p ET28α-Sj26GST和p ET28α-Sj14-3-3为模板,PCR扩增Sj26GST和Sj14-3-3两种目的基因,然后将扩增的两种基因通过基因拼接法进行融合,构建Sj26GST-Sj14-3-3融合基因。再将其插入穿梭表达载体p GEX-1λT,获得重组质粒p GEX-Sj26GST-Sj14-3-3,然后将该质粒电穿孔导入大肠埃希菌BL21(DE3)后利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达;其诱导产物的分析和鉴定采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹法(Westernblot)。将重组质粒p GEX-Sj26GST-Sj14-3-3电穿孔导入Bb中,构建重组Bb(p GEX-Sj26GST-Sj14-3-3)疫苗后经IPTG对该疫苗诱导表达,其诱导产物利用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果琼脂糖凝胶电泳显示成功获得长度为1120bp的Sj26GST-Sj14-3-3融合基因,并构建了重组表达质粒p GEX-Sj26GST-Sj14-3-3;SDS-PAGE结果显示该重组质粒诱导表达产物的Mr约67k Da,其表达水平在诱导5~7h后较高,构建质粒所表达的融合蛋白占菌体总蛋白的19%;Westernblot分析显示Sj感染的兔血清可识别该表达蛋白。PCR及双酶切均显示Bb中被成功导入重组质粒p GEX-Sj26GST-Sj14-3-3。SDS-PAGE显示该重组质粒诱导表达产物的Mr约67k Da,其表达水平在诱导3~4d后较高,导入的重组质粒所表达的融合蛋白占菌体总蛋白的7.9%;Westernblot显示该蛋白能被Sj感染的兔血清识别。结论1.重组质粒p GEX-Sj26GST-Sj14-3-3构建成功,且该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中可得到表达,表达的蛋白具有抗原特异性。2.成功构建日本血吸虫重组Bb(p GEX-Sj26GST-Sj14-3-3)疫苗,该疫苗可表达具有特异抗原性的Sj26GST-Sj14-3-3重组蛋白。