论文部分内容阅读
目的:支气管肺发育不良是围产医学和新生儿学科关注的重点疾病之一,病理基础是肺泡简单性扩大和肺间隔增厚,高氧是诱发肺损伤的重要因素之一,但导致BPD发生的内在调控机制尚不情况。由于miRNA是真原核生物体内一种短的相对保守的基因序列,能够调控从假腺期到肺泡期的整个肺发育过程,且参与了多种儿童呼吸道疾病,如哮喘、囊性肺纤维化、支气管肺发育不良等。因此,本研究着眼于高氧介导肺损伤过程中miRNA的时间差异性表达,寻找在肺囊状期与肺泡期两个阶段的miRNA差异表达,预测下游靶点,探讨与高氧肺损伤的关系。方法:70只新生SD大鼠在生后12小时内混合后随机进入P0、P4、P7、P14组,P4、P7、P14再随机分配到高氧、空气亚组。构建高氧诱导新生大鼠肺损伤模型,高氧组大鼠置于封闭的氧箱中,氧箱中持续通入将2L/min的氧气,并监测和维持24h氧浓度为85%-90%,氧箱内产生的CO2用钠石灰吸收。空气组则置于空气中（Fi O2:21%）,其他条件相同。每24h交换一次母鼠,同时标记小鼠,补充饲料,更换垫料,观察并记录幼鼠的一般生长发育情况,分别在0d、4d,7d,14d收集右肺组织做高通量测序,左肺组织冻存-80℃冰箱待后续验证。再以同样方式造模,取肺组织观察不同组肺组织的形态变化,肺泡发育评价指标采用辐射状肺泡计数（RAC）;根据|FC|＞2,P＜0.001筛选差异性表达的miRNA,miRanda等软件预测靶基因,GO富集和蛋白互作分析关键靶基因及功能;实时荧光定量RT-q PCR验证miR-34a-3p、miR-100-5p、miR-150-5p、miR-34a-5p、miR-21-5p的表达情况;结果:（1）一般生长发育情况:高氧组的新生SD大鼠自造模第7d开始,相对空气组而言,出现体型偏小,周身干瘦,毛发无光泽,步态不稳,头部颤动等表现。并随着高氧暴露时间的延长,空气组大鼠存活率明显高于高氧组;P4d时,高氧组与空气组大鼠体重无显著差异（P＞0.05）;P7d时,高氧组体重增长较空气组低,差异有统计学意义（P＜0.01）,P14d时,两组差异最显著（P＜0.001）;因此随着造模时间延长（P＞4d）,相较空气组而言,高氧组体重增长较缓慢,甚至出现降低;（2）肺组织病理形态改变:从P7d起,高氧组中可见明显的增大的肺泡腔,变薄的肺泡壁,增厚的肺泡间隔,及肺泡结构简化,大小不均匀,可见红细胞和炎性细胞渗出,并随暴露时间的延长,变化越显著;（3）肺泡发育评价—辐射状肺泡计数（RAC）,P4d时,两组RAC值无差异（P＞0.05）;P7d时,高氧组RAC值小于空气组,差异有意义（P＜0.01）;P14d时,空气组RAC值大于高氧组,差异更显著（P＜0.001）;从P4d起,可见空气组RAC值随着日龄升高,而高氧组不增反降;（4）测序结果显示:P（0-4）d（囊状期）,空气组获得106个DEmiRs,高氧组有130个DEmiRs,91个DEmiRs在两组表达,15个、39个只在空气组、高氧组表达;P（4-7）d（肺泡期）,高氧组有3个DEmiRs;空气组0个DEmiRs;P（4-14）d（肺泡期）,高氧组获得114个DEmiRs;空气组有111个DEmiRs,79个DEmiRs在两组表达,32个在空气组表达,35个在高氧组表达。同时,A4＿vs＿H4有7个DEmiRs,2个上调,5个下调;A7＿vs＿H7有16个DEmiRs,7个上调,9个下调;A14＿vs＿H14有42个DEmiRs,28个上调,14个下调;（5）Venn分析:对A0＿vs＿A4、H0＿vs＿H4和A4＿vs＿H4三个miRNA集比较,P4时,高氧组和空气组共获得7个DEmiRs,5个miRNAs在P0-P4的高氧组中表达,余下2个在P4天时才在高氧组表达;对A4＿vs＿A7、H4＿vs＿H7和A7＿vs＿H7比较得知,在P7时,高氧组和空气组有16个DEmiRs,1个miRNA在P4-P7高氧组表达,15个在P7高氧组中表达;同理,A4＿vs＿A14、H4＿vs＿H14和A14＿vs＿H14,在P14时,共有42个DEmiRs,15个miRNAs三组中共有,10个在P（4-14）d高氧组中表达,3个空气组表达,14个在P14时的高氧组表达;再根据Venn图排除重叠区域的DEmiRs,最后保留表达量超过20的DEmiRs,结合文献,确定了P（0-4）d（囊状期）、P（4-14）d（肺泡期）中参与调节的DEmiRs分别为miR-34a-5p和miR-21-5p;（6）靶基因预测:miR-34a-5p在P（0-4）d期间的靶基因有198个;而miR-21-5p在P（4-14）d期间的靶基因有302个;（7）PPI蛋白互作图:将miR-34a-5p和miR-21-5p的靶基因筛选功能集中区域,miR-34a-5p获得60个靶基因,miR-21-5p获得123个靶基因。因此,miR-34a-5p的靶蛋白主要有Pdgfrb-Pdgfra、Ngfr等。miR-21-5p的靶蛋白主要有Mapk1、Stat3等;（8）GO富集:miR-34a-5p靶蛋白在GO Terms中排序靠前的功能有:参与解剖结构发展、血小板衍生生长因子信号通路、细胞过程及NF-κb信号调节、MAPK激酶调节等。而miR-21-5p的靶蛋白功能集中在决定细胞命运和结合生长因子、细胞活力调节、调控MAPK激酶等方面;（9）实时荧光定量RT-q PCR显示,P14d时,高氧组中miR-34a-3p表达增多,miR-100-5p、miR-150-5p的表达降低,差异有意义（P＜0.001）。miR-34a-5p:P4d时,高氧组较空气组表达量增多,差异有意义（P＜0.05）;高氧组P4d与0d相比,P4d表达增多,差异有意义（P＜0.01）,而空气组差别不大（P＞0.05）;miR-21-5p:P14d时,高氧组较空气组升高,差异有意义（P＜0.001）;高氧组P14d比P4d表达增多,差异有意义（P＜0.001）,而空气组P14d比P4d表达量下降,差异有意义（P＜0.05）。结论:高氧诱导新生大鼠肺损伤过程中存在miRNA时间差异性表达。miR-34a-5p和miR-21-5p分别在囊状期和肺泡期表达最显著。miR-34a-5p和miR-21-5p可能是关键调控因子。