研究背景和目的原发性肝癌是一种常见的恶性肿瘤,药物是治疗原发性肝癌的重要手段。大量临床实践[1-12]和实验研究[13-17]表明,复方苦参注射液对肝癌有较好的治疗效果[1.8,9,17]。现代研究证实,复方苦参注射液具有抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞分化和促进肿瘤细胞凋亡等作用[13-16,18-23]。复方苦参注射液虽然在肝癌的治疗过程中能发挥出较好的抗癌效果,但是与大多数中药一样,也存在有效成分不明确,质量控制标准复杂,不同厂家和不同批次的产品治疗效果不一致等等问题和缺点[24-28]。随着现代生物科技的发展,人类对药物作用机制的研究已经深入到了分子水平,并逐步向系统化方向发展。综合基因表达谱芯片的研究结果[29-31]、免疫组化的研究结果以及对关键基因在转录水平和翻译水平的具体分析结果[’3,21,32-35],目前认为,复方苦参注射液主要从以下几个方面发挥其抗癌作用：1、对肿瘤细胞的直接杀伤作用：复方苦参注射液能够抑制肿瘤细胞内细胞周期蛋白E1(Cyclin E1)、生存素(Survivin)和B细胞淋巴瘤／白血病-2基因(B-celllymphoma/Leukemia-2, Bcl-2)的表达,进而导致肿瘤细胞内Caspase-3的大量表达与激活,从而引起肿瘤细胞大量凋亡,达到直接杀伤肿瘤细胞的目的[13,21,32]。2、对肿瘤细胞的间接杀伤作用：复方苦参注射液能够上调Fas等死亡受体在肿瘤细胞表面的表达,进而通过机体免疫系统,如特异性T细胞的细胞毒作用,达到间接杀伤肿瘤细胞的目的[13,30,31]。3、抑制肿瘤的浸润和转移：复方苦参注射液能促进肿瘤细胞表达抑制转移因子nm23[16],还能抑制肿瘤细胞表达粘附分子CD44v6,进而抑制肿瘤浸润和转移[19]。4、抑制肿瘤血管的生成：复方苦参注射液能抑制肿瘤细胞表达VEGF和CXCR4,这可能是复方苦参注射液抑制肿瘤血管生成的主要分子机制[33,3436-38]。5、复方苦参注射液还具有缓解疼痛、提高患者生存质量和提高机体免疫力等方面的作用[39-54]。有鉴于此,本研究设计构建了一个携带RNA干扰序列的溶瘤腺病毒,用RNA干扰的方法,靶向抑制肝癌细胞内Cyclin E1、Survivin和Bcl-2的表达,参照复方苦参注射液直接杀伤肿瘤细胞的主要分子作用机制进行RNA干扰治疗,既克服了传统中药的许多缺点,又充分发挥了基因治疗的优势,从而使构建的携带RNA干扰序列的溶瘤腺病毒具备较好的抗癌能力,并有望发展成为一种新的用于肿瘤治疗的基因药物。复方苦参注射液可以通过抑制肿瘤细胞内Cyclin E1、Survivin和Bcl-2的表达来发挥其直接杀伤作用。而这三个蛋白在细胞的癌变和肿瘤细胞的增殖与凋亡过程中也扮演着重要的角色。其中Cyclin E1和Survivin勺过表达,是引起癌细胞周期调控异常和过度增殖的关键因素[55-64]。而Bcl-2和Survivin则是导致癌细胞凋亡异常的核心因子[65-69]。Cyclin E1过表达会导致细胞G1期进程缩短,细胞增殖失控,进而促进细胞的恶性转化。抑制癌细胞的Cyclin E1的表达,可以使其细胞周期停滞在G0/G1期,阻止其进入S期,从而起到抑制细胞增殖的作用[55,70]；Survivin则同时具备调节细胞周期和抑制细胞凋亡的双重作用,是联系细胞周期和细胞凋亡的关键因子,抑制癌细胞中Survivin的表达,可以抑制肝癌细胞增殖,促进肝癌细胞凋亡[71-75]；Bcl-2在癌细胞抗凋亡过程中也发挥着重要作用,并且与Survivin有协同效应[65,76-79],因此只有同时抑制Survivin和Bcl-2的表达,才能较好的抑制其抗凋亡作用,促使癌细胞走向凋亡RNA干扰(RNAi, RNA interference)作为一种抑制癌基因表达的手段,早已在肿瘤的治疗方面得到应用[80,81]。常用的药物导入方法有两种,一种是体外合成RNAi片段后,直接注射使用；另一种是构建RNAi表达载体,然后将载体导入细胞内,使其在细胞内表达相应的RNAi片段,达到治疗目的。前一种直接注射法虽然简单,但存在免疫反应大,RNAi片段在体内大量降解,利用率低,治疗效果差等缺点,逐渐被淘汰[82]。在第二种治疗方法中,载体的选择是关键,使用普通载体,如pGene-sil,存在转染效率低,抑制作用持续时间短,免疫反应大等缺点,无法在实际应用中取得良好效果[83]。所以本研究采用溶瘤腺病毒(Oncolytic Adenovirus)作为RNAi的载体,由于溶瘤腺病毒能够特异性的在肿瘤细胞中复制增殖,并能在肿瘤组织间自行扩散[84-86],因此将RNAi表达框插入溶瘤腺病毒基因组中,可以使得RNA干扰治疗具备作用时间持久,效率高,靶向性好的优点。将腺病毒复制增殖过程中的必需基因——E1A基因,置于肿瘤特异性启动子的控制之下,可以进一步提高溶瘤腺病毒的靶向性,降低其对正常细胞的毒性[87]。而肿瘤特异性启动子可分为三类：①普遍存在的肿瘤特异性启动子,如Survivin启动子、缺氧启动子和端粒酶启动子等[88-90]；②存在于个别类型肿瘤中的启动子,如卵巢癌和乳腺癌中的DF3/MUC-1启动子,肝癌中的甲胎蛋白(AFP)启动子等[91,92]；③存在于某一类组织中的特异性肿瘤启动子,如前列腺特异性抗原(PSA)启动子等[93]。在为E1A基因选择肿瘤特异性启动子时要兼顾靶向性和启动效率两个方面,比如在构建靶向肝癌细胞的溶瘤腺病毒时,即可选择普遍存在的肿瘤特异性启动子,也可选择甲胎蛋白(AFP)启动子。由于甲胎蛋白启动子的启动效率较低,从而导致溶瘤腺病毒在肝癌细胞中的复制增殖能力大幅度下降,进而使其抗癌能力大打折扣,因此不适合作为E1A基因的启动子。通过对相关的研究结果进行分析[94],发现在靶向肝癌细胞的肿瘤特异性启动子中,Survivin启动子是一个比较合适的选项。综上所述,本研究采用溶瘤腺病毒作为RNA干扰序列的载体,克服了传统RNA干扰载体的许多缺点,提高了溶瘤腺病毒的抗肿瘤能力,并使其有望发展成为一种新的用于肿瘤治疗的药物。设计构建的携带RNA干扰序列的溶瘤腺病毒,用RNA干扰的方法抑制Cyclin E1、Survivin口Bcl-2的表达,尝试了一种参照中药的分子作用机制进行基因治疗的新方法,既克服了中药的许多缺点,又充分发挥出了基因治疗的优势。方法一、携带E1A基因与RNA干扰序列的表达框的构建1、克隆Survivin启动子,并构建亚克隆载体。2、克隆E1A基因,并构建亚克隆载体。3、构建RNA干扰序列,靶向抑制Cyclin E1、Survivin和Bcl-2的表达。4、构建携带E1A基因与RNA干扰序列的表达框。二、构建重组腺病毒1、构建含有目的表达框的重组腺病毒载体pAxcwit2-E1A-RNAi。2、在293T细胞中包装重组腺病毒。3、鉴定收获的重组腺病毒。4、测定重组腺病毒滴度。三、构建的重组溶瘤腺病毒对肝癌细胞内Cyclin E1、Survivin和Bcl-2表达的抑制效果检测1、RT-PCR法检测重组溶瘤腺病毒对肝癌细胞中Cyclin El、Survivin口Bcl-2表达的抑制作用。2、Real time PCR法验证RT-PCR法的检测结果。3、WesternBlot法检测重组溶瘤腺病毒对肝癌细胞中Cyclin E1、Survivin和Bcl-2蛋白表达的抑制作用。四、构建的重组溶瘤腺病毒对肝癌细胞的杀伤作用研究1、细胞形态学观察。2、MTT法(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)检测重组溶瘤腺病毒对肝癌细胞的杀伤作用,分别测定24h、48h、72h和96h时各组的吸光度值,并绘制生长曲线。统计学处理所有计量资料结果用x±s表示。多因素试验资料的方差分析采用析因设计资料的方差分析；两组组间比较应用两独立样本t检验；多组组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差不齐时用(?)Velch校正,在差异显著的前提下进行多重比较,方差齐时采用LSD法,方差不齐时采用Dunnett’s T3法。检验水准a=0.05,双侧检验。采用SPSS13.0for windows统计软件包进行数据分析。结果一、携带E1A基因与RNA干扰序列的表达框的构建1、从HepG2细胞基因组中成功克隆出了大小为276bp的Survivin启动子。2、从293T基因组中成功克隆出了大小为1004bp的E1A基因。3、构建了含有相应酶切位点的靶向抑制Cyclin E1、Survivin和Bcl-2表达的RNA干扰序列。4、成功构建了携带E1A基因与RNA干扰序列的表达框。二、构建重组腺病毒1、含有目的表达框的重组腺病毒载体pAxcwit2-E1A-RNAi勾建成功。2、经过转染、细胞内包装和腺病毒的提取,获得了重组腺病毒。3、经PCR和测序鉴定,含有目的表达框的重组腺病毒构建成功。4、采用终点稀释实验法检测重组腺病毒的滴度为2.1×106。三、构建的重组溶瘤腺病毒对肝癌细胞内Cyclin E1、Survivin和Bcl-2表达的抑制效果检测1、RT-PC法检测结果显示,在重组溶瘤腺病毒的作用下,肝癌细胞中CyclinE1、Survivin和Bcl-2的mRNA含量显著下降。2、Real time PCR法检测结果与RT-PC法检测结果基本一致,证实RNA干扰效果稳定可靠。3、Western Blot法检测结果显示,肝癌细胞中Cyclin E1、Survivin和Bcl-2的蛋白含量也显著降低。四、构建的重组溶瘤腺病毒对肝癌细胞的杀伤作用研究1、溶瘤腺病毒介导的RNA干扰,对肝癌细胞有显著的杀伤作用。2、MTT检测显示,重组溶瘤腺病毒对肝癌细胞的体外杀伤作用显著。结论实验结果显示,溶瘤腺病毒介导RNA干扰对肝癌细胞中Cyclin E1、Survivin和Bcl-2的表达有显著抑制作用,能有效的抑制肝癌细胞增殖,促进肝癌细胞凋亡,对肝癌细胞杀伤作用明显。创新点通过实验证实了用溶瘤腺病毒作为RNA干扰的载体,具备抑制效率高,抑制时间长的优点。发现并通过实验证实,同时靶向抑制Bcl-2、Cyclin E1和Survivin三个基因的表达,能显著抑制肝癌细胞的生长,这对临床上肝癌的RNA干扰治疗有一定的指导意义。尝试了一种参照中药的分子作用机制进行基因治疗的新方法,既克服了中药的许多缺点,又充分发挥出了基因治疗的优势。