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研究背景六价铬(Cr(Ⅵ))是一种人类生活环境中常见的重金属污染物,广泛存在于工业生产过程及排放废弃物中,在我国一些地区,近年来还发现土壤农作物、水生生物以及饮用水中存在六价铬污染,当六价铬经口进入消化道及血液循环后,肝脏是主要的生物代谢器官,在此过程中可导致肝细胞结构或功能的损伤。在动物试验中,研究证实了六价铬诱导肝细胞超微结构崩解、肝细胞凋亡等肝毒性效应。体外试验证实六价铬可诱导L-02肝细胞线粒体损伤与细胞凋亡。线粒体是细胞能量合成的重要细胞器,主要通过三羧酸循环和氧化磷酸化产生能量ATP,后者与细胞生存密切相关。同时,线粒体结构或功能的改变可引起凋亡诱导因子(AIF)与细胞色素C的释放,从而激活半胱氨酸蛋白酶(caspases)家族,导致细胞凋亡。因此,线粒体损伤不仅可导致细胞能量代谢障碍,而且还可诱导细胞凋亡的发生,从分子水平上深入研究六价铬诱导细胞能量代谢障碍及细胞凋亡,有助于阐明六价铬的毒作用机制,从而为铬中毒的生物学监测与预防提供科学依据。目的初步探讨六价铬在不同作用时间、不同处理浓度干扰肝细胞能量代谢相关基因表达及其与细胞凋亡的关系,为深入研究六价铬所致肝细胞凋亡的分子机制提供新的线索。研究方法1.细胞生存率及细胞ATP水平检测采用重铬酸钾(K2Cr207)对L-02肝细胞进行染毒,处理浓度以六价铬离子(Cr(Ⅵ))计算,分别为：0、2、4、8、16、32μmol／L处理时间为12、24、36小时(h)。细胞经Cr(Ⅵ)染毒后,细胞生存率和细胞内ATP含量分别用分光光度法和荧光素生物发光法进行检测,并对细胞生存率和细胞ATP相对含量进行统计分析。2.细胞能量代谢相关基因mRNA水平检测L-02肝细胞经Cr(Ⅵ)分别处理12、24、36h后,细胞内能量代谢相关基因mRNA表达水平采用逆转录-荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)及2-△△CT法进行检测分析,被检测的能量代谢相关基因有线粒体基因组编码的电子呼吸链复合体I亚基1(NADH1)、复合体Ⅳ亚基1(COX1)、复合物V亚基6(ATP-6S)；细胞核基因组编码的已糖激酶异构体2(HK2)、M2型丙酮酸激酶(PKM2)以及线粒体膜电压依赖性阴离子通道VDAC1和腺苷酸转运体ANT17个基因。3.细胞ROS水平及细胞凋亡率检测细胞经Cr(Ⅵ)染毒处理后,细胞ROS水平检测通过原位装载荧光探针2’,7’-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA),于37℃孵育20分钟后,置于酶标仪上以激发／发射波长(488／535nm)进行氧化态二氯荧光素(DCF)荧光强度(FI)检测。细胞凋亡率检测首先用胰酶消化法收集细胞,然后装载荧光探针异硫氰酸荧光素(FITC)标记的钙依赖性磷脂结合蛋白(Annexin V),再加入碘化丙啶(PI)双染,置于流式细胞仪上进行荧光检测(激发／发射波长为488／530nm)。4. siVDAC1肝细胞构建以人同源的VDAC1基因159-177编码区域作为siRNA靶序列,设计靶向该区域的siVDAC1寡核苷酸序列,插入到慢病毒质粒载体pSilencerTM4.1,转化至感受态细菌-DH5a中,使其成功克隆,并对阳性克隆菌落提取质粒DNA,即为siVDAC1质粒,然后采用脂质体2000(lipofectamin TM2000)将siVDAC1质粒转染至L-02肝细胞中,经RT-qPCR和免疫印迹技术(WB)法证实VDAC1低表达肝细胞成功构建,即为siVDAC1肝细胞。5.Cr(Ⅵ)对siVDAC1肝细胞影响的检测试验分为两个组,第一组采用siVDAC1质粒转染的L-02肝细胞(即siVDAC1肝细胞)进行染毒,转染48h后即暴露于Cr(Ⅵ)溶液中,浓度分别为0、2、8、32μmol／L,处理时间为24h。第二组采用Cr(Ⅵ)对空质粒转染的L-02肝细胞(L-02-Scr)进行染毒处理,浓度分别为0、2、8、32μmol/L,处理时间为24h。检测的观察指标为细胞ROS水平、VDAC1mRNA水平、细胞内ATP水平及细胞凋亡率(方法同前)。6.Cr(Ⅵ)对NAC预处理肝细胞影响的检测试验分为两个组,第一组采用Cr(Ⅵ)对L-02肝细胞进行单独染毒,浓度分别为0、2、8、32μmol／L,处理时间为24h。第二组采用N-乙酰半胱氨酸(NAC)20mM对L-02肝细胞预处理6h后,再用Cr(Ⅵ)染毒处理(浓度及时间同第一组)。检测的观察指标为细胞ROS水平、VDAC1mRNA水平、细胞内ATP水平及细胞凋亡率(方法同前)。结果1.Cr(Ⅵ)对细胞内ATP含量的时效与量效关系①4、8、16、32μM Cr(Ⅵ)经12、24、36h染毒后,L-02肝细胞内ATP相对水平12h增加、24h降低、36h轻微回升,呈“V”形曲线变化特点。②2μM Cr(Ⅵ)染毒对细胞内ATP水平影响不明显(P>0.05),32μM Cr(Ⅵ)染毒可致细胞内ATP水平发生明显改变,而与细胞生存率的降低无关(P<0.05),其作用阈值为4μM。2.Cr(Ⅵ)对线粒体呼吸链和糖酵解限速酶基因mRNA表达的影响①细胞采用Cr(Ⅵ)处理12h后, NADH1、ATP-6S基因mRNA表达无明显变化,COX1基因mRNA水平明显降低。Cr(Ⅵ)处理24h后,NADH1和ATP-6S基因mRNA水平明显升高,而COX1基因mRNA水平仍明显偏低(P<0.05)。Cr(Ⅵ)染毒36h后,NADH1mRNA表达水平明显下降,而COX1、ATP-6S基因mRNA表达水平明显升高。②Cr(Ⅵ)染毒12h后,HK2、PKM2基因mRNA表达水平变化不明显。Cr(Ⅵ)染毒24、36h后,HK2、PKM2基因1nRNA均处于明显的低表达水平,大多数处理组抑制率达90%以上(P<0.05)。3.Cr(Ⅵ)对线粒体膜VDAC1、ANT1基因mRNA表达的影响①Cr(Ⅵ)染毒后,细胞核VDAC1mRNA表达在12h明显低于对照组水平,在24h表达水平有所增加,染毒36h后,各剂量组均明显增加(P<0.05)。②Cr(Ⅵ)处理12、24h后,细胞内ANT1mRNA表达明显低于对照组水平,而36h处理后,细胞内ANT1mRNA表达水平明显高于对照组水平(P<0.05)。4.Cr(Ⅵ)对siVDACl肝细胞的毒效应Cr(Ⅵ)对RNA干涉技术处理的siVDAC1肝细胞进行染毒后,与Cr(Ⅵ)对正常L-02肝细胞染毒结果相比较,在32μM Cr(Ⅵ)组,细胞核VDAC1mRNA表达水平受到明显抑制,细胞凋亡率明显下调,但凋亡率仍高于无Cr(Ⅵ)处理的siVDAC1肝细胞水平(P<0.05),细胞内ATP水平则明显回升,但仍低于无Cr(Ⅵ)处理的L-02肝细胞对照组(P<0.05),而Cr(Ⅵ)处理的siVDAC1肝细胞内ROS水平与L-02肝细胞比较无统计学意义(P>0.05)。二种受试细胞的ROS、ATP水平以及凋亡率均与Cr(Ⅵ)处理浓度存在明显量-效关系。5.抗氧化剂NAC预处理对Cr(Ⅵ)细胞毒性的保护效应NAC预处理的L-02肝细胞经Cr(Ⅵ)染毒后,与无NAC预处理的肝细胞比较,在32μM Cr(Ⅵ)组,细胞内ROS水平、VDAC1mRNA水平及细胞凋亡率明显下降,而细胞内ATP水平明显回升(P<0.05)。但NAC预处理后,L-02肝细胞ROS水平、VDAC1mRNA水平、ATP水平及细胞凋亡率与Cr(Ⅵ)处理浓度存在明显量-效关系。结论1.Cr(Ⅵ)可对L-02肝细胞内ATP水平产生影响,ATP水平在Cr(Ⅵ)染毒24h明显降低,提示Cr(Ⅵ)能影响细胞线粒体能量代谢,而36h后轻微的回升提示了线粒体功能的部分恢复。2.线粒体呼吸链基因NADH1、ATP-6S在Cr(Ⅵ)12h处理变化不明显,而24h处理后其mRNA表达出现异常增高,提示Cr(Ⅵ)可能对呼吸链电子传递产生干扰,从而使NADH主呼吸链功能呈代偿性增强。3.细胞核基因编码的线粒体膜蛋白VDAC1在Cr(Ⅵ)12h处理后,其mRNA表达较低,在24h处理后表达有所增加,而36h处理后各剂量组表达均明显升高,提示Cr(Ⅵ)可能通过改变VDAC1基因表达水平而使线粒体膜通透性出现异常,导致细胞能量代谢障碍。4.肝细胞VDAC1基因被干扰后,可在一定程度上减弱Cr(Ⅵ)诱导的细胞ATP水平下降及细胞凋亡,进一步证实肝细胞VDAC1基因与Cr(Ⅵ)诱导肝细胞能量代谢障碍及细胞凋亡的联系。5.肝细胞经抗氧化剂NAC预处理后,随着细胞ROS水平的降低,VDAC1mRNA水平及细胞凋亡率亦明显降低,而细胞内ATP水平则明显得到恢复,实验证实NAC可通过降低细胞ROS水平,影响VDAC1基因表达对Cr(Ⅵ)细胞毒性产生一定的保护效应,并在高浓度Cr(Ⅵ)处理组其保护作用最好。