广州管圆线虫（Angiostrongylus cantonesis,A.cantonesis）,又称为大鼠肺线虫,由我国著名寄生虫学家陈心陶教授于1935年在广州家鼠体内首次发现和命名。自1945年在我国台湾省发现了该虫的首例人体感染病例以来,迄今为止,全球已报告确诊或疑似病例约3000余例。以往,广州管圆线虫病流行于东南亚、太平洋岛屿地区,但近年来在北美、南美、非洲和澳大利亚陆续出现该病的病例报告。我国也多次发生广州管圆线虫病的散发或暴发流行。广州管圆线虫病已成为全球新出现的致死性感染性疾病之一。人是广州管圆线虫的非适宜宿主,可因生食或半生食含有感染期幼虫的中间宿主、转续宿主,或食入被幼虫污染的食物和水而感染。幼虫主要侵犯人体的中枢神经系统,引起嗜酸性粒细胞增多性脑膜脑炎。患者表现为急性头痛、颈项强直、全身疼痛、皮肤过敏等,可伴低热、呕吐,严重病例甚至死亡。临床治疗尚缺乏特异有效的方法,多采用糖皮质激素控制炎症,但是否联合使用杀虫药物仍存在争议。广州管圆线虫的致病机制尚未完全清楚,幼虫移行造成的机械性损伤,及其引发的炎症反应、毒性作用和免疫应答都可能参与其中。自然杀伤细胞（natural killer cells,NK cells）是固有免疫系统的核心成员,无需抗原预先致敏,就可以快速直接地发挥杀伤作用;NK细胞还可分泌多种细胞因子,发挥免疫调节功能。已有研究发现,在某些病理情况下,NK细胞可被招募于中枢神经系统,然而我们并不清楚这些NK细胞只是被动地迁移,还是会主动地参与神经系统的病理损伤。那么,在广州管圆线虫感染导致的脑损伤中,NK细胞是否发挥一定的致病作用或者保护效应呢?为了探讨上述问题,首先,我们构建了广州管圆线虫感染小鼠模型,观察脑组织中是否有NK细胞的浸润;接着,我们检测了广州管圆线虫感染后,脑组织NK细胞的表型和功能,并通过NK细胞的阻断和过继转移实验阐明其在广州管圆线虫感染致脑损伤中的作用;最后,我们探讨了感染后脑组织NK细胞的来源,揭示了脑损伤微环境中招募NK细胞至中枢神经细胞的关键性趋化因子。本研究获得如下主要结果:1.广州管圆线虫感染小鼠脑组织出现NK细胞的浸润小鼠和人都是广州管圆线虫的非适宜宿主,致病过程较为相似。因此,本研究以小鼠为实验对象,构建了广州管圆线虫感染小鼠模型。感染第10天,小鼠脑组织可见少量幼虫入侵;感染第14天,小鼠开始出现神经损伤症状和脑组织炎症反应;感染第18天至第22天,小鼠神经损伤症状加重,脑组织可见更多幼虫入侵,炎症反应加剧,生存率下降,病情最为严重。接着,我们检测了广州管圆线虫感染后,中枢神经系统中是否有NK细胞的浸润。免疫组化和流式细胞术的结果显示感染第14天起,脑组织开始出现NK细胞的浸润,且其在脑组织淋巴细胞中所占的比例和数量随感染时间的延长而逐渐升高,至第22天到达高峰（第 22 天 vs 第 0 天,比例:17.47±6.11%vs 0.45±0.12%,P<0.001;数量:1.32±0.36×105vs 696.9±617.2,P<0.001）。2.广州管圆线虫感染小鼠脑组织浸润的NK细胞杀伤活性和分泌功能增强我们进一步检测了广州管圆线虫感染后,脑组织浸润的NK细胞的表型和功能。实验结果显示,感染第18天小鼠脑组织NK细胞与未感染小鼠的脾脏NK细胞相比,其表面活化分子CD69表达下调（20.07±3.91%vs 31.57±3.35%,P<0.05）,活化性受体 NKp46（22.57±10.74%vs 82.40±4.46%,P<0.001）和NKG2D（3.05±3.44%vs 13.81±6.39%,P<0.05）的表达减少,而抑制性受体NKG2A持续低表达;此外,脑组织NK细胞杀伤YAC-1细胞的能力增强（效靶比为20:1的杀伤毒性19.37%vs 8.35%）,表面CD107a分子的表达上调（11.58±2.16%vs2.91±0.50%,P<0.001）,分泌 IFN-γ 的水平升高（44.14±2.21 pg/ml vs 18.78±2.06 pg/ml,P<0.001）。提示,广州管圆线虫感染后,脑组织浸润的NK细胞可能通过穿孔素/颗粒酶途径,以及产生更多的IFN-γ,增强其杀伤活性。3.广州管圆线虫感染小鼠脑组织浸润的NK细胞具有加重脑损伤的致病作用我们进一步通过NK细胞的阻断实验和过继转移实验,观察耗竭和增加NK细胞对广州管圆线虫感染所致脑损伤的影响。结果显示,广州管圆线虫感染小鼠阻断NK细胞后,生存率增加（阻断组vs感染组:91.33%vs 77.08%,P<0.05）,体重上升（17.35±1.38 gvs 15.61±1.1 g,P<0.05）,神经损伤症状有所缓解,脑组织炎症反应减轻（IL-1β 25.88±2.38 pg/mg vs 30.75±2.83 pg/mg,IL-6 12.88±1.23 pg/mg vs 15.08±1.13 pg/mg,TNF-α 57.17±4.20 pg/mg vs 64.68±4.34 pg/mg,P<0.05）。而与之相反的是,广州管圆线虫感染小鼠过继转移NK细胞后,虽生存率和体重无显著改变,但神经损伤症状有所加重,脑组织炎症反应加剧（IL-1β36.36±1.89 pg/mg vs 30.75±2.83 pg/mg,IL-6 18.08±0.55 pg/mg vs 15.08±1.13 pg/mg,TNF-α 76.84±1.21 pg/mg vs 64.68±4.34 pg/mg,P<0.05）。表明广州管圆线虫感染小鼠脑组织浸润的NK细胞,发挥了加重脑损伤的致病作用。4.广州管圆线虫感染小鼠脑组织浸润的NK细胞来源于骨髓的造血增多和外周NK细胞的迁移为了阐明脑组织NK细胞的来源,我们检测了广州管圆线虫感染对小鼠脾脏、外周血和骨髓中NK细胞比例和数量的影响。结果显示,感染后小鼠脾脏中NK细胞的比例和数量减少（第18天vs第0天,比例:2.48±0.18%vs4.09±0.41%,P<0.01;数量:0.49±0.15×106 vs 2.07±0.42×106,P<0.001）,外周血中 NK 细胞的比例和数量也减少（比例:3.51±0.62%4 vs 5.99±0.66%,P<0.01;数量:5371±299 vs 5.05±2.48×106,P<0.001）,而骨髓中NK细胞的比例显著增多（7.42±1.24%vs 2.36±0.36%,P<0.001）,其中NK前体细胞/成熟NK细胞的比值也逐渐升高（0.57±0.10 vs 0.29±0.109,P<0.001）。此外,脾脏NK细胞与脑NK组织细胞的比例（r=-0.790,P<0.01）和数量（r=-0.846,P<0.01）呈负相关,而骨髓NK细胞与脑组织NK细胞的比例呈正相关（r=0.866,P<0.001）。据此推测,广州管圆线虫感染后,脑组织浸润的NK细胞来源于骨髓的造血增多和外周NK细胞的迁移。5.广州管圆线虫感染小鼠脑损伤微环境中的多种趋化因子参与对NK细胞的招募为了明确广州管圆线虫感染后,招募NK细胞至脑组织的关键性趋化因子,我们检测了小鼠脑损伤微环境中趋化因子及其受体的表达水平。结果显示,广州管圆线虫感染促进了脑组织中多种趋化因子表达的上调,其中升高较为显著的有CCL3（第18天vs第0天:3.56±0.27pg/mg vs 2.58±0.35pg,P<0.001）、CX3CL1（421.7±122.2 pg/mg vs 112.6±13.38 pg/mg,P<0.001）和 CXCL10（706.6±17.71 pg/mg vs 607.00±54.10 pg/mg,P<0.05）,且其相应受体 CCR1、CCR4、CCR5（CCL3 受体）,CX3CR1（CX3CL1 受体）和 CXCR3（CXCL10受体）的表达水平也上调。我们推测,在广州管圆线虫感染中,脑损伤微环境中的趋化因子CCL3、CX3CL1和CXCL10可能发挥了招募骨髓和外周NK细胞至中枢神经系统的关键作用。综上所述,本研究首次发现广州管圆线虫感染小鼠脑组织中有NK细胞的浸润,揭示了脑组织中浸润的NK细胞在广州管圆线虫感染中有加重脑损伤的作用,并探讨了脑组织中招募NK细胞迁移的关键性趋化因子。我们的实验结果有助于深入了解广州管圆线虫的致病机制,全面认识NK细胞在脑损伤性疾病中的作用,并为广州管圆线虫病的临床治疗提供实验依据和研究方向。