论文部分内容阅读
动物初情期出现的早与迟直接关系到性成熟和以后的繁殖性能,但初情期启动的具体作用机制还不清楚。一般认为与促性腺激素释放激素(goadotropin releasing hormone, GnRH)脉冲释放有关。研究表明神经激肽B (neurokinin B, NKB)是一种GnRH调节因子,与初情期启动息息相关,被认为是继Kisspeptin之后的又一重要调控因子,而Kisspeptin能促进GnRH脉冲释放,被认为是初情期启动的“看门人”(gatekeeper)。近期有研究表明GnRH上有NK3R受体的表达,并且外源性的NKB及其受体激动剂也有放大Kisspeptin的效应,那么NKB到底是直接通过其受体作用于GnRH的脉冲释放还是通过Kisspeptin来间接调控GnRH的分泌来进一步调控初情期启动还不清楚。因此,有必要探明NKB对初情期启动影响的具体途径。本试验以初情期启动前和成年雌性大鼠为研究对象,通过侧脑室给予NK、NKB拮抗剂并结合GPR54受体拮抗剂处理,观察初情期启动时间的变化,采用免疫荧光三标技术检测大鼠生殖轴上NKB、Kisspeptin和GnRH的表达变化,并结合Image-Pro Plus 6.0(IPP 6.0)和Image J软件分析各组大鼠生殖轴上的平均荧光强度及阳性细胞数目,解析NKB对大鼠初情期启动和GnRH和Kisspeptin蛋白表达的影响。同时结合实时荧光定量PCR、酶联免疫和放射性免疫等分析方法,来阐述NKB对大鼠初情期启动中GnRH和Kisspeptin基因表达以及对性腺激素水平的影响。结果显示：(1)初情期启动前NKB组、NKB+生理盐水组、Kp-234+NKB组大鼠阴门开启时间显著提前(P<0.05),卵巢重量显著增加(P<0.05); NKB拮抗剂组和Kp-234+生理盐水组大鼠阴门开启时间明显延迟(P<0.05)。(2)初情期启动时各组大鼠与阴性对照组相比,NKB组与NKB+生理盐水组下丘脑的GnRH和Kiss-1mRNA增加(P<0.05),提示NKB促进下丘脑GnRH和Kisspeptin基因的表达。(3)大鼠下丘脑不同核团上NKB、GnRH和Kisspeptin勺表达强度不同,NKB和Kisspeptin主要在弓状核和室旁核表达,而GnRH主要在分布于下丘脑正中隆起和弓状核。侧脑室给予NKB后显著增加大鼠弓状核NKB阳性细胞数目(P<0.05),正中隆起GnRH阳性细胞数(P<0.05)以及弓状核和室旁核Kisspeptin阳性细胞数(P<0.05),提示NKB能够既能促进下丘脑GnRH和Kisspeptin的表达。(4)NKB分布于腺垂体和卵巢的间质、颗粒细胞与卵泡膜,侧脑室注射NKB的大鼠其垂体和卵巢上Kisspeptin的表达显著增加说明NKB参与垂体-性腺轴的调控。(5)初情期启动前的NKB拮抗剂组、阴性对照组血清中NKB平均含量显著低于其它组(P<0.05)；NKB组和NKB+生理盐水组血清中E2和P4的平均含量显著高于NKB拮抗剂组和阴性对照组,提示NKB能够增加性腺激素的分泌。由以上结果得出如下结论：(1)NKB使大鼠初情期提前启动。(2)NKB使下丘脑GnRH和Kisspeptin基因和蛋白表达上调,提示NKB调控大鼠初情期启动是通过GnRH和Kisspeptin来实现。(3)NKB除了在中枢水平发挥调控生殖作用外,还可能直接调控垂体和卵巢的功能。(4)NKB能够增加外周血液中性腺激素水平,从而进一步影响大鼠初情期的启动。