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目的:
体外同步实验比较叶下珠、胡桃楸等20种常用抗肿瘤中药水提物、醇提物的抗肿瘤活性,初步筛选出抗肿瘤活性强的中药;通过建立H22荷瘤小鼠模型,口服给药,比较石见穿、叶下珠和胡桃楸醇提物体内抗肿瘤作用;初步探讨叶下珠醇提物抗肿瘤作用机制,为临床应用中药抗肿瘤治疗提供一定的实验依据。
方法:
分别采用水和乙醇为溶媒提取20种中药,制成水提浸膏和醇提浸膏。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法分别测定20种中药水提物和醇提物在浓度2.5mg/ml和5.0mg/ml下(按生药计算)作用48小时后对人低分化胃腺癌细胞株BGC-823、人胃腺癌细胞株AGS和人高分化胃腺癌细胞株MKN-28的体外抑制率。建立昆明小鼠皮下H22肝癌移植瘤模型,小鼠种瘤24小时后称重,随机分成5组(即石见穿组、叶下珠组、胡桃楸组、环磷酰胺组和蒸馏水组)。石见穿组、叶下珠组和核桃楸组小鼠剂量均为12g/(kg·d)(按生药计算),环磷酰胺组按每日25mg/(kg·d)给药。各组均每日灌胃一次,给药体积均为0.5ml/只。连续灌胃给药10天,同时观察对小鼠一般状况及体重的影响。停药后48小时处死小鼠,剥取肿瘤、称瘤重,以抑瘤率为指标观察叶下珠、石见穿和胡桃楸醇提物的体内抑瘤作用。通过集落形成试验观察叶下珠醇提物对人高分化胃腺癌细胞株MKN-28集落形成的影响;MTT法测定叶下珠醇提物作用24小时、48小时、72小时后对人高分化胃腺癌细胞株MKN-28的增殖抑制率;将不同浓度叶下珠醇提物作用于人高分化胃腺癌细胞株MKN-28,48小时后倒置显微镜下观察细胞形态变化并拍照;AnnexinV/PI流式细胞术检测叶下珠醇提物作用48小时后人高分化胃腺癌细胞株MKN-28的凋亡情况。
结果:
1.20种中药的水提浸膏的得率在79.8mg/g至554.4mg/g之间,其中得率最高的三种中药为山海螺(554.4mg/g)、凌霄花(419.3mg/g)和胡桃楸(416.5mg/g);醇提浸膏的得率在43.8mg/g至303.4mg/g之间,醇提得率最高的三种中药为凌霄花(303.4mg/g)、菝葜(197.8mg/g)和墓头回(191.7mg/g)。
2.在5mg/ml生药浓度下醇提中药浸膏对三株胃癌细胞抑制率均大于75%的中药有龙葵、莪术、墓头回、石上柏、木馒头、蛇舌草、半枝莲、叶下珠和胡桃楸九种中药;而在5mg/ml生药浓度下水提中药浸膏对三株胃癌细胞抑制率均大于75%的中药仅有叶下珠一种中药。
3.石见穿、叶下珠、胡桃楸醇提物对小鼠H22移植瘤的抑瘤率分别为23.18%、33.77%和37.75%。
4.在2mg/ml和1mg/ml两个浓度下叶下珠醇提物对MKN-28胃癌细胞集落形成具有不同程度的抑制作用,浓度大者,抑制作用更强。经叶下珠醇提物作用后,倒置显微镜下观察培养孔内肿瘤细胞密度减低,分裂像较对照组减少,肿瘤细胞生长增殖受抑制,部分细胞变圆,细胞表面皱缩,脱壁漂浮,或见细胞碎片。MTT法测定细胞增殖抑制率结果表明,叶下珠醇提物对MKN-28细胞增殖有抑制作用,并具有剂量和时间依赖性。AnnexinV/PI流式细胞术检测提示叶下珠醇提物能诱导人胃癌细胞MKN-28发生凋亡。
结论:
1.20种中药的水提浸膏和醇提浸膏的得率存在较大差别。一般水提浸膏得率大于醇提浸膏得率。
2.20种中药对人低分化胃腺癌细胞株BGC-823、人胃腺癌细胞株AGS和人高分化胃腺癌细胞株MKN-28的抑制率存在差别,其中多数中药的醇提物的抑瘤作用优于水提物。
3.在相同口服剂量下(即按生药计算12g/kg·d),叶下珠、石见穿和胡桃楸醇提物对H22荷瘤小鼠均具有一定的抗肿瘤作用。
4.叶下珠醇提物能抑制人胃癌细胞MKN-28增殖,诱导细胞凋亡可能是其抗肿瘤作用机制之一。