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成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptors, FGFRs)家族有4种酪氨酸激酶家族成员(FGFR1-4),他们可与22种FGFs配体形成二聚体激活PLC-Y、Ras/Raf/MEK/ERK、RJAK/STAT等下游信号通路,在骨的形成、血管形成、神经形成、损伤修复、肿瘤形成等方面起重要作用。其中FGFR2在某些肿瘤、皮肤、骨骼等疾病的产生过程中起关键作用,FGFR2多种突变可以导致一种骨罕见疾病-Apert综合征的发生。Apert综合征(Apert Syndrome, AS)又称Ⅰ型尖头并指(趾)综合征(acroocephalo syyndactyly),是颅缝早闭(Craniosynostosis)类疾病当中最严重的一种,是一种罕见疾病,新生儿发病率在1/160,000与1/65,000之间。1906年,Apert首次对其进行了报道,属于常染色体显性疾病,是由FGFR2基因突变引起的,并且该病患儿多为散发患者,由新生突变引起。其主要症状为尖头、短头、面中部发育不良及并指(趾)畸形等。最近Park等在对一名Apert病人的研究中发现了FGFR2基因的一种新的突变类型,即E731K突变。对这一新的突变的初步研究中发现,在没有FGF配体结合的情况下,FGFR2激酶能够发生自身磷酸化激活ERK-MAP通路。Apert综合征是一种典型的单基因单位点突变引起的遗传疾病,对于研究骨矿化异常引起的疾病是一个良好的模型,在对很多骨矿化方面的研究中体外实验得到的结果很多时候不能在体内得到验证,是因为体内和体外环境有很大差异,而对于这一疾病模型的研究中我们只要得到FGFR2的致病突变则会使体外实验模型发生矿化异常,减少环境差异对实验结果的影响。为了进一步研究FGFR2基因E731K突变导致Apert综合征的原因以及更进一步的阐述FGFR2E731K突变对成骨细胞基质小泡(matrix vesicles, MVs)的矿化能力影响,我们设计了以下实验。目的：本研究旨在阐述引起Apert综合征的FGFR2E731K突变在体外影响成骨细胞矿化的机制以及这种机制与基质小泡(matrix vesicles, MVs)之间的关系以及对MVs的影响,为进一步研究FGFR2基因的功能和MVs与疾病的联系提供一种新思路。方法：本研究拟采用人骨肉瘤细胞系Saos-2,通过将FGFR2(fibroblast growth factor receptor2, FGFR2)基因的野生型和FGFR2E731K突变用慢病毒载体转入Saos-2细胞中进行过表达来检测FGFR2E731K突变对成骨细胞矿化和MVs矿化的影响。本研究拟采用外显子测序的方法首先排除Saos-2细胞中原本表达的FGFR2基因有无功能性突变位点,然后对慢病毒转染之后的MT(突变型FGFR2E731K)细胞和WT(野生型FGFR2细胞)用β-磷酸甘油和抗坏血酸诱导后,检测其碱性磷酸酶(ALP)活性并用茜素红染色的方法检测两种细胞的矿化能力,同时用荧光定量PCR的方法检测两种细胞中矿化标志蛋白ALP、Runx2、OCN、CollAl的mRNA水平表达情况来研究FGFR2E731K突变在细胞水平上对成骨细胞矿化的影响。然后采用ExoQiuck试剂提取两种细胞的MVs,检测其ALP活性和用吸光度检测其矿化悬液的浑浊度的方法检测其矿化能力,来研究FGFR2E731K突变对MVs的矿化活性的影响。结果：(1)测序证明Saos-2细胞FGFR2基因外显子中没有功能突变位点,可以进行突变功能研究。(2)ALP和茜素红实验均发现MT(突变型FGFR2E731K)细胞和WT(野生型FGFR2)细胞在抗坏血酸和β-磷酸甘油的诱导下,MT细胞的ALP活性和矿化结节数均明显高于WT细胞。(3)荧光定量PCR的实验结果表明,ALP、Runx2、OCN、CollAl这四种矿化标志基因在MT细胞中比在WT细胞中有明显的表达上调。(4)MVs的ALP活性检测结果和吸光度实验表明,相较于WT细胞中提取的MVs, MT细胞中提取的MVs有着更高的ALP活性,在相同时间内产生的羟基磷灰石(HA)也更多。结论：本研究显示FGFR2E731K基因突变能使成骨细胞拥有更强的矿化能力并且能上调矿化标志基因ALP、Runx2、OCN、CollAl的表达,说明这一突变位点是一个功能获得型突变。在对MVs的研究中显示,FGFR2E731K基因能明显增强MVs的矿化能力,这表明FGFR2E731K突变有可能是通过影响MVs的活性来影响成骨细胞矿化的,同时也能说明FGFR2膜蛋白所引导的下游信号通路能影响MVs的活性。