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目的:在哺乳动物睾丸中,支持细胞（Sertoli cell,SC）对生殖细胞的发育至关重要,SC的最终数目决定精子的产生能力。SC增殖仅发生在胎儿和青春期前期,主要由卵泡刺激素和旁分泌因子调节,在此期间的未成熟SC可能成为影响睾丸发育的致病性因素的重要靶点。TNFα（tumor necrosis factorα）在睾丸中具有多种生物学活性,参与生精细胞发育的多个过程。SC是TNFα发挥病理或生理性作用的主要靶点。TNFα通过识别SC上的受体参与成熟BTB（blood-testis barrier）周期性重建、细胞凋亡和炎症反应。研究发现,TNFα可诱导体外培养的未成熟SC增殖,但缺乏其调节途径和作用机制研究及体内实验验证。本研究试图揭示TNFα影响未成熟SC增殖的作用机制及其对BTB成熟过程的影响。方法:1.TNFα对未成熟SC增殖的影响及泛素化PCR Array筛选差异基因。体外分离培养10 d龄SD鼠原代SC培养1-7 d,于第2 d给予不同浓度TNFα处理,于不同时间点分别采用（1）CCK-8、EdU检测细胞增殖率;（2）泛素化PCR Array筛选差异基因,qPCR验证TNFα（10 ng/ml）对Fbxo4表达影响;（3）免疫印迹检测PCNA、Fbxo4、cyclin D1表达水平;（4）免疫共沉淀检测Fbxo4与cyclin D1的相互作用及cyclin D1泛素化水平。2.Fbxo4过表达对TNFα促SC增殖效应的影响。构建含大鼠Fbxo4基因全长的腺病毒重组质粒,包装病毒颗粒后选取适宜MOI值于培养第2 d感染原代未成熟SC 24 h,于第4 d进行TNFα处理,检测细胞增殖率和相关蛋白表达量的改变。3.抑制NFκB活性对TNFα促SC增殖效应的影响。免疫印迹检测相关信号通路蛋白活性。体外培养10 d SD大鼠SC,筛选抑制NFκB通路的最佳PDTC浓度,于第2 d采用PDTC（10μM）预处理SC 2 h后加入TNFα联合处理48h,检测细胞增殖率和相关蛋白表达量的改变。4.体内研究检测TNFα对未成熟大鼠BTB功能建立的影响。体内实验选取12 d未成熟的雄性SD大鼠作为研究对象。连续3 d每天腹腔注射TNFα（10μg/kg b w）,对照组注射等体积的dd H2O,于不同时间点（16 d、20 d、24 d、26 d、30 d、32 d、35 d）进行如下实验:（1）生物素标记法检测大鼠体内BTB通透性,比较各组BTB功能成熟的时间点;（2）免疫荧光检测BTB连接蛋白分布;（3）免疫印迹检测PCNA、Fbxo4、cyclin D1和连接蛋白水平。结果:1.TNFα抑制cyclin D1泛素化并促进未成熟SC的增殖:CCK-8、EdU实验和PCNA表达水平变化显示TNFα处理明显促进未成熟SC增殖;泛素化PCR Array筛选出5个相关差异基因（>3倍）;免疫印迹显示TNFα显著下调E3泛素连接酶Fbxo4,而其底物cyclin D1水平升高;免疫共沉淀显示TNFα抑制了cyclin D1与Fbxo4的相互作用及其泛素化。2.Fbxo4过表达抑制TNFα对未成熟SC的促增殖作用:腺病毒Ade-Fbxo4体外感染原代未成熟SC,免疫印迹检测Fbxo4成功过表达;CCK-8和EdU试验表明,与Adv-Fbxo4组相比,Adv-Fbxo4+TNFα组细胞增殖无显著变化;免疫印迹及免疫沉淀结果显示,与Adv-Fbxo4组相比,Adv-Fbxo4+TNFα组PCNA、cyclin D1的表达水平及cyclin D1泛素化水平均无显著变化。3.TNFα通过活化NFκB促进未成熟SC的增殖:免疫印迹发现TNFα处理后p-p38/p38、p-IκBα/IκBα及p-NFκB p65/NFκB p65比值增加,说明TNFα可活化未成熟SC的p38 MAPK及NFκB通路;CCK-8及EdU试验均显示NFκB抑制剂PDTC处理后,TNFα不能促进未成熟的SC增殖（p38 MAPK抑制剂则无此效应）;免疫印迹及免疫沉淀结果亦表明PDTC处理后,TNFα不再引起PCNA、Fbxo4和cyclin D1的表达水平及cyclin D1泛素化水平的明显改变。此外,Fbxo4过表达后TNFα仍能活化NFκB。4.TNFα处理未成熟大鼠引起BTB成熟滞后:体内BTB功能检测发现TNFα处理组BTB于35 dpp左右功能成熟明显晚于对照组（24 dpp）。免疫荧光显示TNFα处理后连接蛋白occludin、JAM-A在BTB的分布明显低于相同天龄的对照组。但随着大鼠天龄的增大,TNFα预处理引起的occludin、JAM-A的表达分布差异越来越小,并分别在26 dpp（JAM-A）和32 dpp（occludin）后恢复正常。结论:TNFα通过NFκB途径抑制cyclin D1的泛素化降解,进而促进未成熟SC殖并诱导大鼠BTB成熟延迟。