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肠出血性大肠杆菌(entrerohemorrhagic E. coli, EHEC) 0157:H7是一种新型的肠道致病菌,可引起严重的食源性疾病。感染该菌可致腹泻、出血性结肠炎(hemorrhagic colitis,HC),还可引发溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome,HUS)及血栓性血小板减少紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura,TTP)等严重并发症,严重者可导致死亡[1-3]。目前,对EHEC O157:H7感染仍缺乏有效的治疗方法。临床上针对其感染主要采用抗生素治疗及相应的对症治疗。新近的研究发现,抗生素使菌体破裂,导致O157:H7菌志贺毒素(Shiga toxin,Stx)的释放水平大大提高,使用抗生素有可能加重病情,增加发生并发症的危险并引起死亡。EHEC O157:H7主要产生两种毒素,分别称为志贺毒素Ⅰ(Stx1)和志贺毒素Ⅱ(Stx2)。目前,Stx2与配体腺嘌呤的复合物晶体结构已被解析[5,6],毒素的活性位点也已明确。A亚单位包括A1和A2两个片段。A1片段为毒性活性片段,毒力活性中心位点位于第77位酪氨酸上,A2片段插入5个B亚基形成的孔中,通过B亚基与细胞受体结合而发挥毒力作用。因此,直接针对EHEC O157:H7最主要的致病活性分子Stx2A研制其中和毒素抗体,将是研制O157:H7治疗性抗体药物优选的设计策略。但由于鼠源性单抗应用人体会引起人抗鼠抗体反应(HAMA),这为临床实际应用带来了不便,因此制备特异性人源化抗体是目前待解决的问题。抗原表位定向选择法(EGS)是近年发展的快速人源化抗体的新方法。该方法通常是先用亲本鼠单抗重(或轻)链可变区基因与人源抗体轻(或重)链基因库配对,构建成鼠-人杂合噬菌体抗体库,以固相化抗原进行亲和筛选,得到与鼠源重(或轻)链组合识别特异抗原的人源轻(或重)链基因。进一步用筛到的特异性人抗体轻(或重)链去配人源重(或轻)链基因库,构建成人源噬菌体抗体库,再经同一抗原进行亲和力筛选,从而获得与亲本鼠源抗体针对同一表位的完全人源化的新型抗体。本研究拟采用抗原表位定向选择法,对构建的鼠源抗EHEC O157:H7 Stx2a1噬菌体抗体进行人源化改造,从而为解决临床EHEC O157:H7感染者的治疗研究奠定实验基础。本实验共分为三部分内容:第一部分:EHEC O157:H7 Stx2A1亚单位截短片段Stx2a1的克隆、表达、纯化及免疫学性质鉴定目的:表达、纯化EHEC O157:H7 Stx2A1毒力亚单位截短片段Stx2a1对其免疫性进行鉴定。方法:应用生物信息学软件DNAstar对Stx2A1全长序列进行分析,根据分析结果将全长Stx2A1羧基端疏水性很强的部分氨基酸截短,从EHEC O157:H7 99A021基因组中扩增stx2a1,克隆于pET-22b(+)载体,转化到工程菌Escherichia coli BL21(DE3)中。用IPTG诱导表达融合蛋白。对表达产物进行SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot分析。结果:Stx2a1经0.1 mM IPTG诱导为可溶形式表达,SDS-PAGE蛋白电泳表明表达及纯化的蛋白的相对分子量约为25 kDa,纯化出的Stx2a1蛋白含量达98%以上,Western blot鉴定显示该蛋白可与抗Stx2A单抗S1D8特异性反应。结论:成功表达纯化出EHEC O157:H7 Stx2A1毒力亚单位截短片段Stx2a1,这为下一步筛选到抗EHEC O157:H7毒力亚单位的抗体奠定了抗原基础。第二部分:鼠源性抗EHEC O157:H7 Stx2噬菌体Fab抗体库的构建及筛选目的:以灭活的天然毒素Stx2免疫小鼠制备鼠源性抗EHEC O157:H7 Stx2噬菌体Fab抗体库,筛选鼠源性抗EHEC O157:H7 Stx2a1Fab抗体。方法:甲醛法灭活天然毒素Stx2,类毒素免疫小鼠,利用RT-PCR从脾淋巴细胞扩增出全套的鼠Fab抗体的轻、重链,克隆入pComb3x噬粒载体中,电转化大肠杆菌XL1-Blue后建立鼠源性抗EHEC O157:H7 Stx2噬菌体Fab抗体库。通过稀释滴定、限制性酶切对所建的抗体库的库容、重组率分别进行鉴定,以M13K07辅助噬菌体超感染,先用天然毒素Stx2为抗原对挽救展示的噬菌体抗体库进行淘筛和鉴定,然后对筛选到的抗体进行抗原亚单位的特异性鉴定,最后对筛选到了针对Stx2a1的Fab抗体的阳性克隆进行测序及比对。结果:成功构建1.56×107CFU、重组率为80%的鼠源性噬菌体抗体库。首先利用纯化的天然毒素Stx2进行三轮淘选后,对筛选到的抗体再进行Stx2a1抗原的特异性鉴定,得到两个阳性克隆,测序后NCBI中比对及同源性分析表明,其中轻链可变区氨基酸序列与GenBank中已注册的鼠免疫球蛋白κ轻链、重链可变区氨基酸序列同源性为98.5%、99.6%左右。结论:成功构建了鼠源性抗EHEC O157:H7 Stx2噬菌体Fab抗体库,并筛选到两株鼠源性抗EHEC O157:H7 Stx2a1噬菌体Fab抗体库。第三部分抗天然Stx2毒素活性片段Stx2a1的人源噬菌体Fab抗体库的构建及特异性人源Fab抗体的筛选、表达目的:分别以鼠源抗Stx2a1的轻、重链为模板,筛选人源性抗Stx2a1抗体的重、轻链,构建人源性抗Stx2a1的噬菌体Fab抗体。进而从全人噬菌体Fab抗体库中筛选出抗Stx2a1的Fab抗体,进行表达鉴定。方法:利用RT-PCR从正常人全血淋巴细胞扩增出全套的人Fab抗体的轻链基因,克隆入含鼠源性重链的pComb3x/mFd噬粒载体中,电转化大肠杆菌XL1-Blue后建立人鼠杂合抗EHEC O157:H7 Stx2a1噬菌体Fab抗体库。通过稀释滴定、限制性酶切对所建的抗体库的库容、重组率分别进行鉴定,以M13K07辅助噬菌体超感染,对筛选到的抗体进行Stx2a1抗原亚单位的特异性筛选鉴定。再以同样方法技术,利用RT-PCR从正常人全血淋巴细胞扩增出全套的人Fab抗体的重链Fd基因,将其与已筛选到的人抗体轻链配对构建针对Stx2a1的全人Fab抗体,以纯化的Stx2a1为抗原,经过三轮吸附-洗脱-扩增,最后对phage ELISA筛选到的阳性克隆进行诱导表达及Western blot特异性鉴定。结果:成功构建3.1×106CFU、重组率为90%的全人Fab噬菌体抗体库。对phage ELISA筛选到的抗体诱导表达,得到两个可溶性表达产物,经Western blot特异性鉴定均是针对抗原Stx2a1的抗体。结论:通过抗原表位定向选择法,成功得到了全人抗EHEC O157:H7 Stx2a1噬菌体Fab抗体库,并筛选到两株人源性抗EHEC O157:H7 Stx2a1噬菌体Fab抗体,对今后预防及治疗EHEC O157感染奠定了良好基础。