‘红绵蜜柚’生长素诱导相关基因CgPCNT115的克隆及功能分析

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‘红绵蜜柚’(Citrus grandis(L.)Osbeck.cv.‘Hongmianmiyou’)是近年从‘琯溪蜜柚’(C.grandis(L.)Osbeck.cv.‘Guanximiyou’)芽变株系中选育的优良蜜柚新品种,具有汁多化渣、酸甜适中、丰产性好等优点。在四川产区常用枳(Poncirus trifoliata)作为‘琯溪蜜柚’的砧木,而课题组在推广栽培‘红绵蜜柚’时发现,以枳为砧木时嫁接苗表现出接穗叶片黄化甚至死亡现象,以香橙(C.junos)为砧木时嫁接苗生长势良好,‘琯溪蜜柚’以枳为砧木同样可以正常生长发育。针对该现象,基于课题组前期转录组研究数据显示,CgPCNT115基因与生长素诱导相关,它可能与枳砧‘红绵蜜柚’幼苗黄化密切相关。生长素诱导蛋白PCNT115在许多植物中已经鉴定,其涉及的生理生化过程较多,但相关功能及机理并不清楚,因此,本研究以‘红绵蜜柚’为材料,克隆CgPCNT115基因及启动子序列,与‘琯溪蜜柚’克隆序列进行了比较分析。同时,对CgPCNT115在不同嫁接组合、叶片不同发育时期、不同组织中的表达特性进行了测定与分析;并对CgPCNT115基因在不同浓度的外源生长素(IAA)及生长素运输抑制剂三碘苯甲酸(TIBA)处理下的响应特性进行了探究;瞬时过表达叶片对其功能进行了初步研究。主要结果如下:(1)‘红绵蜜柚’CgPCNT115基因的克隆以‘红绵蜜柚’为材料,以‘琯溪蜜柚’为对照,从gDNA中克隆得到CgPCNT115基因及其启动子,基因序列均为1772 bp,但内含子区域存在一些单碱基差异;启动子序列均为2122 bp,且序列完全一致。CgPCNT115属于醛酮还原酶家族(AKRs),含有两个跨膜结构区;基于序列比对和系统树构建表明,柚CgPCNT115基因与甜橙(C.sinensis(L.)Osbeck)遗传关系最近,其次是克里曼丁橘(C.clementina);启动子序列中存在一个转录起始位点及核心启动子区域,含有一些特殊的顺式作用元件,如热胁迫响应元件、激素响应的元件、MYB特异性结合元件等。(2)CgPCNT115的表达特性CgPCNT115基因表达量在不同嫁接组合中均随着叶片的发育总体呈上升的趋势,在PhaseⅣ(叶片SPAD值为60±5)时,枳砧‘红绵蜜柚’CgPCNT115基因表达量极显著低于两个对照(枳砧‘琯溪蜜柚’、香橙砧‘红绵蜜柚’)。CgPCNT115基因在枳砧‘红绵蜜柚’果肉中表达量最低,在花中表达量最高;其次在果实的果皮、海绵层及果肉中表达量相对较低,在茎段、花及叶中表达量较高。(3)CgPCNT115的响应特性对枳砧‘红绵蜜柚’新梢叶片进行3个浓度(50、100、200 mg·L-1)的外源IAA及TIBA处理,通过半定量及实时荧光定量实验结果显示:CgPCNT115的表达量在两种处理下8 h内均出现了快速响应的过程,表现为先升高后降低的趋势;50 mg·L-1的IAA及TIBA处理响应均为最快,且相同浓度下IAA处理的响应速度要略快于TIBA处理。因此,CgPCNT115对于各浓度的IAA及TIBA处理均存在短时间急剧上调的表达特性,该基因对于IAA含量变化是存在灵敏的响应机制;同时,相比于外源IAA处理,TIBA处理具有响应的滞后性。(4)CgPCNT115功能的初步研究CgPCNT115基因通过枳砧‘红绵蜜柚’叶片瞬时过表达发现,注射后5 d开始出现黄化表型;总叶绿素及总类胡萝卜素含量均在注射后5 d开始出现显著下降;通过HPLC法测定其内源激素,发现GA3含量自注射后3 d开始直到注射后7 d显著高于对照;通过对内源IAA响应及信号转导关键基因(CgARF、CgAUX/IAA、CgGH3以及CgSAUR)进行表达量测定,发现除CgAUX/IAA外,其余均出现显著下调,通过相关性分析后发现,均为显著或极显著负相关。因此,CgPCNT115基因对于叶绿素及类胡萝卜素含量、GA3合成方面可能具有一定调控作用,同时对IAA响应途径存在着负调控作用。上述研究表明,CgPCNT115基因及其启动子在‘红绵蜜柚’与‘琯溪蜜柚’中相对保守;CgPCNT115在枳砧‘红绵蜜柚’PhaseⅣ时表达量较低,在茎段、花及叶中表达量较高,在果实的果皮、海绵层及果肉中表达量相对较低;在外源IAA及TIBA处理下CgPCNT115基因均出现短时间内表达上调的响应特性;将CgPCNT115基因在枳砧‘红绵蜜柚’叶片中瞬时过表达,注射后5 d开始出现黄化表型,总叶绿素、总类胡萝卜素及GA3含量均出现下降,IAA响应及信号转导关键基因中CgARF、CgGH3以及CgSAUR均出现下调;综上,CgPCNT115基因可能参与并竞争IAA的响应及信号转导、IAA与GA3的互作以及IAA调控植物的生长发育等,其在枳砧‘红绵蜜柚’叶片黄化过程中可能扮演重要的角色。
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