J亚群禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J）是一种反转录病毒,引起家禽免疫抑制、生长抑制和多器官组织出现肿瘤,给养殖业带来严重的经济损失。相对于其他亚型,ALV-J拥有更强的致病性和传染性,也是目前我国鸡群中发病率最高、感染较为严重、影响深远的一种亚群。目前还没有发现有效的商业化药物或疫苗可供使用,其感染致病致瘤机制有待进一步研究。本研究基于前期ALV-J感染与正常脾脏组织的转录组数据,结合小RNA测序数据,通过生物信息学联合分析筛选出与ALV-J感染致瘤相关的转录本（包括mRNAs、circRNAs、lncRNAs或miRNAs）、转录本间可能的网络互作关系以及病毒感染的关键信号通路。然后从上游和下游两个角度揭示鸡Bcl11b（B-cell lymphoma/leukemia 11B）在ALV-J病毒感染过程中的作用及分子调控机制,并以期进一步完善ALV-J感染致瘤机制的基础研究,也为寻找有效的生物标记以提高抗病育种工作提供理论基础。主要研究内容如下:1.为了探索家禽中ALV-J感染过程中关键基因、circRNAs、lncRNAs以及ceNRA互作网络关系,同时为解析鸡J亚群禽白血病病毒感染分子调控机理提供基础资料,本研究利用已有的ALV-J自然感染发病与正常脾脏组织的转录组数据,结合同样本的小RNA测序数据,获得全面系统的ALV-J感染与非感染鸡脾脏组织的转录组数据,并且通过差异表达转录本韦恩图联合分析、功能富集分析以及ceRNA互作网络等生物信息学手段共筛选出与ALV-J感染致病致瘤相关的15个候选基因（包括Bbx、Bcl11b、Foxk1、Pag1、Tyro3、Brat1、Ctsb、Scube3、Ulk3、Dock4、Zfhx3、Fmr1、Aoc3、Ralb 以及 Mll）、多个相关转录本及转录本间可能的网络互作关系以及病毒感染的关键信号通路,通过在其他感染组织中验证发现Bcl11b表达水平差异最为显著,达80倍,且Bcl11b信号通路复杂,可能是ALV-J感染致病致瘤的关键因子。因此,首先将鸡Bcl11b基因作为研究ALV-J感染致病致瘤的机制切入点。2.为探讨鸡Bcl11b基因的功能,首先克隆获得了鸡Bcl11b的CDS序列,发现存在可变剪接体,并且发现一种新的剪接形式,蛋白结构预测分析发现3号外显子缺失会影响蛋白质三级结构的锌离子结合位点;qRT-PCR检测结果发现鸡Bcl11b在肝、脾、肺、淋巴和肾等组织中均有表达,且在脾、肺和淋巴中高表达,在鸡胚成纤维细胞中高表达;进一步在Bcl11b基因低表达的细胞DF-1中过表达Bcl11b同时检测细胞增殖活力、凋亡及周期变化,发现Bcl11b的过表达显著降低了细胞活力、提高了细胞凋亡水平（P<0.05）,促凋亡基因表达量也显著升高（P<0.05）,对细胞周期影响不显著（P>0.05）,在CEF细胞中干扰Bcl11b表达后细胞凋亡水平显著降低（P<0.05）,对细胞周期影响不显著（P>0.05）。这说明了鸡Bcl11b通过促进细胞的凋亡从而抑制细胞活力和存活,而非阻滞细胞周期。3.为了进一步探索鸡Bcl11b基因在ALV-J感染过程中的作用,首先构建了 ALV-J体外感染CEF细胞产生上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的模型,检测体外感染过程中Bcl11b基因表达水平变化趋势与细胞凋亡水平一致,同时检测多个凋亡相关蛋白发现p53蛋白水平在感染后0～2 dpi高表达,其下游蛋白Bax表达水平在在感染后0～3dpi表达水平较高,下游作用因子细胞色素C（CytC）在2-4dpi高表达,符合p53调控的线粒体介导的细胞凋亡模式;Bcl11b基因和凋亡相关基因的表达与凋亡变化吻合。这也说明在体外,鸡Bcl11b基因参与线粒体介导的细胞凋亡。4.进一步探讨了 miRNA靶向Bcl11b参与ALV-J感染的分子机制,本研究首先克隆获得鸡Bcl11b 3’UTR序列1755 nt;通过miRDB、Targetscan、PicTar等在线预测软件并与测序分析数据结合预测靶向鸡 Bcl11b基因的miRNAs并结合双荧光素酶报告系统验证gga-miR-1612、gga-miR-6701-3p可以靶向鸡Bcl11b;通过分别对miRNAs的过表达和抑制同时检测对鸡Bcl11b的表达水平以及细胞凋亡、周期的影响,结果发现gga-miR-1612、gga-miR-6701-3p可以通过靶向Bcl11b影响Bcl11b基因的转录和翻译,进而影响了被转染细胞的凋亡水平;通过对ALV-J体外感染CEF细胞过程中Bcl11b基因表达水平、细胞凋亡水平出现拐点的时候（3～5dpi）抑制内源性gga-miR-1612、gga-miR-6701-3p的表达,发现靶基因Bcl11b表达水平显著上调,细胞凋亡水平也显著上调（P<0.05）。这表明gga-miR-1612、gga-miR-6701-3p通过靶向Bcl11b基因介导细胞凋亡。5.为了探究circRNA₂420-miRNA-Bcl11b的调控机制,首先通过qRT-PCR、分子克隆等方法对circRNA₂420特征进行分析,发现其是高稳定闭合环状转录本,且其成环并不依赖侧翼内含子上的重复序列;接着对circRNA_<sub>2420进行过表达和干扰表达,检测鸡Bcl11b的表达以及细胞的凋亡水平变化,发现过表达circRNA₂420后Bcl11b表达量显著上调（P<0.05）,细胞凋亡水平也随之上调（P<0.05）;反之干扰circRNA₂420表达后Bcl11b表达量显著下调（P<0.05）,细胞凋亡水平也相应下降（P<0.05）,但是细胞周期没有变化（P>0.05）;通过双荧光素酶报告系统验证靶向Bcl11b基因的两个miRNA（gga-miR-1612 和 gga-miR-6701-3p）与 circRNA₂420 的作用方式以及鸡Bcl11b与circRNA₂420的互作,发现gga-miR-1612可以靶向结合鸡circRNA₂420影响荧光素酶活性,circRNA₂420也间接影响了Bcl11b基因的活性。说明circRNA₂420可以通过吸附miRNAs（包括gga-miR-1612）调控鸡Bcl11b的表达,进而影响细胞的凋亡。6.为了探究Bcl11b介导细胞凋亡的机制,通过ChIP-seq实验发现Bcl11b作为一种锌指蛋白转录因子可以靶向多个细胞凋亡相关的基因进而参与细胞凋亡及信号通路等多种生物学过程,为揭示Bcl11b的功能及作用机制提供了线索。综上所述,本研究发现ALV-J感染过程中circRNA_<sub>2420可以通过吸附miR-1612间接促进鸡Bcl11b基因的表达,而Bcl11b作为一种锌指蛋白转录因子调控凋亡相关基因的转录,进而介导细胞的凋亡调控ALV-J感染。研究结果进一步完善ALV-J感染致瘤机制的基础研究,也为寻找有效的生物标记以提高抗病育种工作提供新的靶点和思路。