陆地棉转GhbZIP1基因CMS种质创新及其不育机理研究

来源 :广西大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:junhao1987
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棉花(Gossypium hirsutum L.)是世界上最主要的天然纤维作物之一,也是重要的油料作物。棉花的杂种优势十分显著,但目前棉花细胞质雄性不育(Cytoplasmic male sterility,CMS)种质资源匮乏,利用的CMS系主要为哈克尼西棉细胞质。其细胞质供体为二倍体,细胞核供体为四倍体,因质核互作严重不协调,恢复系少,难以推广利用。为了解决远源杂交核置换回交所致的质核严重不协调问题,亟需选育质核同源CMS系。本研究基于陆地棉细胞核雄性不育两用系“洞A”的转录组测序结果,筛选到一个在不育株和可育株差异表达的基因GhbZIP1,并将其转入一个性状优良的陆地棉栽培种J4B中。在获得转基因雄性不育突变株后,将其与J4B进行饱和回交成功创制出了CMS系J4A。随后对J4A进行形态学和细胞学观察、线粒体基因组水平、全转录组水平和生化指标测定分析,得出以下主要结果:(1)形态学观察发现,与J4B相比,J4A花器官缩小、花柱突出、花药干瘪而不开裂,败育类型为无花粉型。(2)花粉败育特征观察发现,J4A的花药败育发生在减数分裂期,表现为在花药发育的整个过程中绒毡层细胞不发生降解,无四分体结构。亚细胞超微结构观察发现:J4A花药四分体时期绒毡层细胞的线粒体内嵴模糊。(3)线粒体重测序结果显示:3个CMS系(J4A-1、J4A-2和J4A-3)与其保持系J4B的线粒体基因组差异较小,同源性均高于99%;筛选到4个与CMS相关的ORFs(orf116b、orf186a-1、orf186a-2和orf305a)。(4)通过Illumina Hiseq 4000测序平台进行转录组测序,结果显示:在检测到的62,270个基因中,共筛选到4,461个差异表达基因(7.16%),其中2,940个基因上调表达,1,521个基因下调表达。生物信息学分析发现,489个差异表达基因富集在氧化还原反应条目;47个差异表达基因参与糖酵解代谢途径,且下调基因数大于上调基因数。(5)通过Illumina Hiseq 4000测序平台进行miRNA测序,共获得1,293个miRNA,其中已知miRNA 734个,新miRNA 559个;预测到1,009个靶基因和1,054个靶基因位点;筛选到26差异表达miRNA。根据miRNA与其靶基因负调控关系,将m RNA测序结果与miRNA测序结果进行关联分析,筛选到一对可能与小孢子减数分裂异常有关的靶基因对:ghi-MIR7484-10/MAPKK6。(6)花药发育3个时期(花粉母细胞时期、减数分裂期和单核期)主要生化指标检测。活性氧(Reactive oxygen species,ROS)代谢相关生化指标(SOD、Mn-SOD、POD、CAT、H2O2和MDA)测定结果显示,在减数分裂期和单核期,J4A的SOD、Mn-SOD、POD和CAT酶活均显著低于J4B,H2O2和MDA含量均显著高于J4B。推测由于减数分裂期抗氧化酶(SOD、Mn-SOD、POD和CAT)活性降低,活性氧清除能力降低,导致活性氧(H2O2和MDA)积累。糖代谢相关生化指标(蔗糖、淀粉、可溶性糖和果糖)测定发现,在花药发育的减数分裂期和单核期,J4A花药中的蔗糖含量均高于J4B;而淀粉、可溶性糖和果糖含量均低于J4B。推测由于蔗糖发生积累,使葡萄糖和果糖的生成减少,进而导致淀粉含量降低和可溶性糖含量下降。
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