目的：本课题研究麻杏石甘方药效/毒两性成分对中枢神经系统的存效减毒整合作用机制,以期既能充分发挥药物疗效,又可最大限度降低毒副反应,安全、合理地使用麻黄及含麻黄制剂。方法：(1)急性毒性实验：分别给小鼠一次性灌胃(ig)或分两次ig(两次ig之间间隔4h)不同剂量的麻黄、炙麻黄及麻杏石甘方水煎液,观察7d后统计死亡率,用Bliss软件计算LD50及其95%可信限。(2)自主活动实验：分别一次性灌胃给予小鼠生理盐水、麻黄碱、麻黄水煎液、炙麻黄水煎液、麻杏石甘方水煎液,用多功能自主活动仪测定小鼠在ig前及ig后30min、1h、2h、3h、4h时15min内自主活动次数,每次测定前先让小鼠在自主活动仪中适应15min。实验结果应用SPSS13.0统计软件,采用重复测量方差分析和单向方差分析处理。(3)戊巴比妥钠睡眠实验：分别灌胃给予小鼠生理盐水、麻黄碱、麻黄水煎液、炙麻黄水煎液、麻杏石甘方水煎液,每天ig一次,连续ig 6天,末次ig给药45min后各组均腹腔注射(ip)5g/ml戊巴比妥钠70g/kg(0.14ml/只),观察小鼠睡眠情况。以翻正反射消失1min以上为睡眠,记录睡眠潜伏期;以翻正反射消失至恢复为睡眠持续时间,记录睡眠持续时间。实验结果应用SPSS13.0统计软件,采用单向方差分析处理。(4)敞箱实验：分别灌胃给予小鼠生理盐水、麻黄碱、麻黄水煎液、炙麻黄水煎液、麻杏石甘方水煎液,每天ig一次,连续ig 7天,末次ig给药45min后将小鼠放入敞口木箱正中一格,适应10s后开始观察并记录15min内小鼠跨格数、站立次数、修饰次数。实验结果应用SPSS13.0统计软件,采用单向方差分析处理。(5)HE染色和5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)免疫组化实验：分别灌胃给予小鼠生理盐水、麻黄碱、新麻黄水煎液、陈麻黄水煎液、麻杏石甘方水煎液,每天ig一次,连续ig 6天。末次给药后1h,心脏灌注取脑,10%中性甲醛固定,常规脱水、透明、石蜡包埋,冠状切片,选取含额叶皮层和海马的切片供HE染色和免疫组化染色,观察并比较新麻黄、陈麻黄和麻杏石甘方对大鼠脑组织结构的影响及对大鼠皮层、海马内5-HT、NE表达的影响。(6)对大鼠不同脑区四种氨基酸类神经递质含量的影响：分组与给药同(5)。末次给药后1h,在冰台上迅速取出脑组织并分离出额叶皮层、海马、下丘脑和脑干,LC-ESI+-MS-MS法测定不同脑区中谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)的含量。实验结果应用SPSS13.0统计软件,采用单向方差分析处理。(7)大鼠灌胃给予新麻黄、陈麻黄及麻杏石甘方后额叶皮层中麻黄碱类生物碱含量的比较：分组与给药同(5)。末次给药后1h,在冰台上迅速取出脑组织并分离出额叶皮层,LC-ESI+-MS-MS法测定额叶皮层中麻黄碱(EP)、伪麻黄碱(PEP)、去甲基麻黄碱(NEP)和去甲基伪麻黄碱(NPEP)的含量。实验结果应用SPSS13.0统计软件,采用单向方差分析处理。结果：(1)急性毒性实验：麻黄、炙麻黄和麻杏石甘方的LDso分别为134.88g/kg、204.87g/kg、7.42g/kg,LD50 (Feiller校正)95%的可信限分别为118.56-156.99g/kg、174.46-236.28g/kg、63.009-123.82g/kg,其中麻黄为一次性ig,炙麻黄和麻杏石甘方均为分两次ig,两次ig之间间隔4h。(2)自主活动实验：主效应与交互效应分析：不同时间之间有显著性差异(F=99.289,P=0.000)；时间与药物(组别)之间存在交互效应(F=1.497,P=0.043)。不同药物之间存在显著性差异(F=2.742,P=0.005)。时间因素不同水平LSD多重比较的结果表明,第一个时间点和其余五个时间点之间均有显著性差异,均为P=0.000,即给药前与给药后30min、1h、2h、3h、4h均有显著差异。分组因素单独效应分析：ig30min时,与麻黄低剂量组比较,炙麻黄低剂量组的自主活动次数降低,差异无显著性意义,P=0.989,麻杏石甘方低剂量组的自主活动次数降低,差异无显著性意义,P=0.860;ig 1h时,与麻黄低剂量组比较,炙麻黄低剂量组的自主活动次数降低,差异无显著性意义,P=0.867；ig 2h时,与麻黄低剂量组比较,炙麻黄低剂量组的自主活动次数降低,差异无显著性意义,P=0.996;ig 4h时,与麻黄低剂量组比较,麻杏石甘方低剂量组的自主活动次数降低,差异无显著性意义,P=1.000。时间因素单独效应分析：麻杏石甘方高剂量组各时间点之间自主活动次数均无显著差异,P=0.119；与给药前比较,麻黄低剂量组ig后30min、1h、2h、3h、4h时的自主活动次数均降低,差异有显著性意义,P值分别为0.005、0.003、0.001、0.001、0.000;与ig后30min比较,麻黄低剂量组ig后3h自主活动次数降低,差异有显著性意义,P=0.011；与ig后1h比较,麻黄低剂量组ig后3h自主活动次数降低,差异有显著性意义,P=0.002;与给药前比较,炙麻黄低剂量组ig后30min、1h、2h、3h、4h时的自主活动次数均降低,差异有显著性意义,P值分别为0.001、0.001、0.000、0.000、0.007;与ig后30min比较,炙麻黄低剂量组ig后2h自主活动次数降低,差异有显著性意义,P=0.008。(3)戊巴比妥钠睡眠实验：与麻黄高剂量组比较,麻杏石甘方高剂量组睡眠时间延长,差异有显著性意义,P=0.018,炙麻黄高剂量组睡眠时间延长,差异无显著性意义,P=0.060；与麻黄中剂量组比较,麻杏石甘方中剂量组睡眠时间延长,差异有显著性意义,P=0.029,炙麻黄中剂量组睡眠时间缩短,差异无显著性意义,P=0.259；与麻黄低剂量组比较,麻杏石甘方低剂量组睡眠时间延长,差异有显著性意义,P=0.000,炙麻黄低剂量组睡眠时间缩短,差异无显著性意义,P=0.665。与生理盐水组比较,麻杏石甘方中剂量组的睡眠时间缩短,差异无显著性意义,P=0.355,麻杏石甘低剂量组的睡眠时间延长,差异无显著性意义,P=0.592；与生理盐水组比较,麻黄碱组、麻黄高剂量组、麻黄中剂量组、麻黄低剂量组、炙麻黄高剂量组,炙麻黄中剂量组、炙麻黄低剂量组、麻杏石甘方高剂量组的睡眠时间均缩短,P值分别为0.036、0.000、0.002、0.001、0.008、0.000、0.000、0.029。潜伏期整体比较组间无显著性差异,F=0.841,P--0.593。(4)敞箱实验：与麻黄高剂量组比较,麻杏石甘方高剂量组的跨格数增加,差异有显著性意义,P=0.000;站立次数整体比较组间无显著性差异,F=1.306,P=0.238;修饰次数整体比较组间无显著性差异,F=1.667,P=0.124。(5)HE染色和5-HT、NE免疫组化实验：HE染色：新麻黄各剂量组额叶皮层和海马均可见到明显的神经细胞凋亡。与新麻黄相应剂量组比较,陈麻黄各剂量组、麻杏石甘方各剂量组额叶皮层和海马中神经凋亡细胞明显减少。5-HT免疫组化实验：新麻黄各剂量组额叶皮层和海马中均很难见到5-HT阳性神经元。与新麻黄相应剂量组比较,陈麻黄高、中剂量组额叶皮层和海马中5-HT阳性神经元数量明显增加且颜色明显变深,陈麻黄低剂量组、麻杏石甘方高、低剂量组仅额叶皮层中5-HT阳性神经元数量增加且颜色变深。NE免疫组化实验：与生理盐水组比较,新麻黄各剂量组仅额叶皮层中NE阳性神经元数量增加且颜色变深。与新麻黄相应剂量组比较,陈麻黄各剂量组、麻杏石甘方各剂量组仅额叶皮层中NE阳性神经元数量明显减少且颜色明显变浅。(6)对大鼠不同脑区四种氨基酸类神经递质含量的影响：与新麻黄高剂量组比较,陈麻黄高剂量组额叶皮层中Glu、Asp和Gly含量均降低,差异均有显著性意义,P值均为0.000;与新麻黄中剂量组比较,陈麻黄中剂量组和麻杏石甘方中剂量组额叶皮层中Glu含量均降低,差异有显著性意义,P值分别为0.010、0.015；与新麻黄低剂量组比较,陈麻黄低剂量组、麻杏石甘方低剂量组额叶皮层中Glu含量降低,差异有显著性意义,P值均为0.000。与陈麻黄高剂量组比较,麻杏石甘方高剂量组额叶皮层中GABA含量均增加,差异有显著性意义,P=0.036。与新麻黄高剂量组比较,陈麻黄高剂量组海马Glu、GABA、Gly含量均降低,差异有显著性意义,P值分别为0.017、0.000、0.000,麻杏石甘方高剂量组海马GABA、Gly含量均降低,差异有显著性意义,P值分别为0.005、0.027。与新麻黄中剂量组比较,陈麻黄中剂量组海马Glu、GABA含量均降低,差异有显著性意义,P值分别为0.001、0.012,麻杏石甘方中剂量组海马Glu、GABA含量均降低,差异有显著性意义,P值分别为0.012、0.038。与新麻黄低剂量组比较,陈麻黄低剂量组Glu、GABA、Gly含量均降低,差异有显著性意义,P值分别为0.037、0.000、0.002,麻杏石甘方低剂量组海马中GABA、Gly含量均降低,差异有显著性意义,P值分别为0.000、0.011。与陈麻黄高剂量组比较,麻杏石甘方高剂量组海马中Gly含量增加,差异有显著性意义,P=-0.006。与新麻黄高剂量组比较,陈麻黄高剂量组和麻杏石甘方高剂量组海马中Glu/GABA增加,差异有显著性意义,P值分别为0.010、0.017;与新麻黄中剂量组比较,陈麻黄中剂量组和麻杏石甘方中剂量组海马中Glu/GABA增加,但差异无显著性意义,P值分别为0.579、0.619；与新麻黄低剂量组比较,陈麻黄低剂量组和麻杏石甘方剂量组海马中Glu/GABA增加,差异有显著性意义,P值分别为0.001、0.000。与新麻黄高剂量组比较,陈麻黄高剂量组下丘脑中Glu、Asp、GABA、Gly含量均降低,P值分别为0.003、0.003、0.008、0.014,麻杏石甘方高剂量组Glu、Asp、GABA、Gly含量均降低,差异有显著性意义,P值分别为0.001、0.006、0.010、0.004。与新麻黄中剂量组比较,陈麻黄中剂量组下丘脑中Glu、Gly含量均降低,差异有显著性意义,P值分别为0.000、0.029,麻杏石甘方中剂量组下丘脑中Glu、Gly含量均降低,差异有显著性意义,P值分别为0.007、0.022。与新麻黄低剂量组比较,陈麻黄低剂量组下丘脑中Glu含量降低,差异有显著性意义,P=0.003,麻杏石甘方低剂量组下丘脑中Glu、Gly含量均降低,差异有显著性意义,P值分别为0.001、0.012。与新麻黄高剂量组比较,陈麻黄高剂量组、麻杏石甘方高剂量组下丘脑中Glu/GABA增加,差异无显著性意义,P值分别为0.0794、1.000。与新麻黄中剂量组比较,陈麻黄中剂量组、麻杏石甘方中剂量组下丘脑中Glu/GABA降低,差异无显著性意义,P值分别为0.781、0.671。与新麻黄低剂量组比较,陈麻黄低剂量组、麻杏石甘方低剂量组下丘脑中Glu/GABA降低,差异无显著性意义,P值分别为0.690、1.000。脑干中Glu、Asp、GABA、Gly含量及Glu/GABA值整体比较,组间均无显著性差异,F(P)分别为0.625(0.790)、0.504(0.884)、1.345(0.241)、1.169(0.321)、1.289(0.247)。(7)大鼠灌胃给予新麻黄、陈麻黄及麻杏石甘方后额叶皮层中麻黄碱类生物碱含量的比较：与新麻黄相应剂量组比较,陈麻黄各剂量组、麻杏石甘方各剂量组额叶皮层中EP、PEP、NEP、NPEP含量均无显著性差异(P值略)。结论：(1)按急性毒性排序,炙麻黄<麻黄<麻杏石甘方。(2)在给药后的某些时间点,与麻黄低剂量组比较,炙麻黄低剂量组和麻杏石甘汤低剂量组自主活动次数均有降低趋势,即与麻黄低剂量组比较,含等剂量麻黄的炙麻黄和麻杏石甘方有中枢抑制作用增强趋势,即在一定程度上体现了中药炮制、组方的减毒作用。(3)在本文实验条件下,以小鼠戊巴比妥钠睡眠潜伏期和睡眠持续时间为指标,与麻黄相应剂量组比较,麻黄蜜炙后20、10、5g/kg(以生麻黄计)中枢抑制作用无显著变化,而麻杏石甘方20、10、5g/kg(以生麻黄计)均能显著增强中枢抑制作用,且有量效负相关关系,其中麻杏石甘方10、5g/kg(以生麻黄计)组能恢复到生理盐水组水平。(4)敞箱实验结果表明：与麻黄高剂量组比较,麻杏石甘方高剂量组的跨格数显著增加,提示麻杏石甘方组大鼠脑内DA水平升高。推测,麻杏石甘方高剂量组通过调节神经环路来调节中枢兴奋性,即麻黄组方成麻杏石甘方后,中枢兴奋性有了显著变化。(5)HE染色结果表明：麻黄碱组、新麻黄各剂量组的额叶皮层和海马中均可见到明显的细胞凋亡,说明这些部位已出现不可逆性损伤。与新麻黄相应剂量组比较,陈麻黄各剂量组、麻杏石甘方各剂量组凋亡细胞数量减少、程度减轻,从形态学层面证明麻黄陈用或组方成麻杏石甘方后,神经毒性降低。免疫组化结果表明：陈麻黄各剂量组和麻杏石甘方高、低剂量组均能通过增加额叶皮层内5-HT表达,降低额叶皮层内NE表达来降低中枢兴奋性,陈麻黄高、中剂量组同时还能增加海马内5-HT表达来降低中枢兴奋性,麻杏石甘方中剂量组则通过降低额叶皮层NE的表达来降低中枢兴奋性,从免疫组化层面证明了麻黄陈用或组方成麻杏石甘方后,神经毒性降低。(6)在大鼠的额叶皮层、海马、下丘脑等脑区,与相应剂量的新麻黄比较,陈麻黄和麻杏石甘方各剂量均能不同程度地降低中枢兴奋毒性,说明麻黄炮制或组方后确能减毒。但在大鼠的脑干部位,与相应剂量的新麻黄比较,陈麻黄和麻杏石甘方各剂量均未显示降低中枢兴奋毒性作用。(7)大鼠灌胃给予新麻黄、陈麻黄及麻杏石甘方后额叶皮层中麻黄碱类生物碱含量的比较结果表明：与新麻黄相应剂量组比较,陈麻黄各剂量组、麻杏石甘方各剂量组额叶皮层中EP、PEP、NEP、NPEP含量均无显著性差异。推测其原因可能为：虽然陈麻黄水煎液和麻杏石甘方水煎液中麻黄碱等生物碱的含量较新麻黄水煎液低,但吸收较快或(且)代谢较慢,在大鼠灌胃1h后,其额叶皮层中麻黄碱等生物碱的含量并不比新麻黄相应剂量组低。从脑组织中麻黄碱等生物碱的含量层面,阐明麻杏石甘方的减毒作用机制,可能为陈麻黄水煎液和麻杏石甘方水煎液组麻黄类生物碱成分吸收较快或(且)代谢较慢,先于新麻黄达到Cmax(脑组织中的最大药物浓度),但前二者的Cmax要明显低于新麻黄的Cmax,故前二者的药效持久且副作用小。这有待深入进行麻黄类生物碱成分的药代动力学研究去验证。(8)药物反复长期使用可导致耐受性,使同样的血药浓度(或组织中的药物浓度)不能引发相同的药效强度。推测,麻黄药材或含麻黄的复方与麻黄碱一样反复使用后具有耐受性,与新麻黄相应剂量组比较,陈麻黄各剂量组、麻杏石甘方各剂量组额叶皮层中EP、PEP、NEP、NPEP含量均无显著性差异,但新麻黄与陈麻黄、麻杏石甘方相应剂量组的药理效应却有显著性差异,这就解释了结论(5)和(6)。