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第一部分临床水平研究HMGB1/RAGE与自噬在肾癌组织中的表达【目的】通过检测肾透明细胞癌的临床样本,分析HMGB1/RAGE和自噬相关标记物(LC3、Beclin-1、PIK3),明确肾癌组织中HMGB1/RAGE的表达和自噬是否具有相关性,临床水平研究肾癌中HMGB1/RAGE和自噬的表达情况。【方法】Western-Blot、qRT-PCR和免疫荧光法检测12例肾透明细胞癌和相应癌旁组织的HMGB1/RAGE和自噬相关标记物(LC3、Beclin-1、PIK3)的表达情况。【结果】1.Western-Blot见肾透明细胞癌中HMGB1蛋白表达水平(0.6138±0.0691)明显高于癌旁肾组织表达水平(0.2247±0.0512)(P<0.001);RAGE蛋白表达水平(0.5467±0.0368)明显高于癌旁肾组织表达水平(0.2803±0.0415)(P<0.001);LC3蛋白表达水平(0.4994±0.0674)明显高于癌旁肾组织表达水平(0.1293±0.0213)(P<0.001);Belcin-1蛋白表达水平(0.5370±0.0608)明显高于癌旁肾组织表达水平(0.1556±0.0359)(P<0.001);PIK3蛋白表达水平(0.4189±0.0570)较癌旁肾组织表达水平(0.2427±0.0463)有升高趋势(P=0.025)。2.qRT-PCR见肾透明细胞癌中HMGB1 m RNA表达水平(1.1978±0.2311)较癌旁肾组织表达水平(0.8093±0.2531)有增高趋势,但无统计学差异(P=0.098);RAGE m RNA表达水平(1.7319±0.2784)明显高于癌旁肾组织表达水平(0.8759±0.2043)(P=0.002);LC3 m RNA表达水平(1.5504±0.1878)明显高于癌旁肾组织表达水平(0.7423±0.1126)(P=0.004);Belcin-1 m RNA表达水平(1.4572±0.1757)明显高于癌旁肾组织表达水平(0.6501±0.0530)(P=0.001);PIK3 m RNA表达水平(1.2629±0.1539)明显高于癌旁肾组织表达水平(0.7201±0.0804)(P=0.001)。3.免疫荧光见肾透明细胞癌中HMGB1/RAGE和自噬蛋白LC3、Beclin-1、PIK3的表达较癌旁正常组织明显增强。【结论】肾透明细胞癌组织中HMGB1/RAGE和自噬(LC3,Beclin-1,PIK3)均较癌旁组织明显升高。HMGB1/RAGE和自噬可能在肾肿瘤中发挥重要作用,对肾癌的发生发展具有临床意义。第二部分细胞水平研究HMGB1/RAGE对肾癌细胞自噬、凋亡、迁移、增殖和血管生成的影响【目的】通过检测肾透明细胞癌的临床样本,Western-Blot和qRT-PCR方法检测12例肾透明细胞癌和相应癌旁组织的HMGB1/RAGE和自噬相关标记物(LC3、Beclin-1、PIK3)的表达情况,发现肾癌组织中HMGB1、RAGE和LC3、Beclin-1、PIK3较癌旁组织中均有明显升高,初步印证HMGB1/RAGE和自噬可能对肾癌的发生发展具有临床意义。本部分研究旨在通过体外实验,高表达HMGB1,si RNA沉默HMGB1,可溶性RAGE(s RAGE)阻断HMGB1和RAGE的结合,细胞水平证实HMGB1通过结合RAGE,诱导细胞自噬,降低凋亡水平,促进肾癌细胞血管生成、增殖以及迁移。【方法】选用人肾癌细胞株A489、ACHN作为研究对象,分别利用质粒转染技术高表达HMGB1,si RNA干扰技术沉默HMGB1,s RAGE阻断HMGB1和RAGE的结合,缺氧环境下培养72h后,采用qRT-PCR、Western blot和免疫荧光检测自噬相关标记物(LC3、Beclin-1)、HMGB1和RAGE,流式细胞术和CCK-8检测细胞凋亡、增殖变化,Transwell小室检测各组细胞的迁移情况。肾癌细胞与血管内皮细胞共培养,分别高表达HMGB1、沉默HMGB1,s RAGE阻断HMGB1和RAGE的结合,采用qRT-PCR和Western blot检测VEGF和VEGFR-2反应血管生成的基因和蛋白表达变化。【结果】1.对HMGB1表达进行抑制,可使肾癌细胞的活性和迁移能力减弱,加快肿瘤细胞的凋亡速度。通过CCK8和流式细胞术检测各组细胞的生长和凋亡情况,发现HMGB1的干扰、过表达和s RAGE对A498和ACHN细胞的生长和凋亡有影响。HMGB1-si RNA转染组和s RAGE处理组肾癌细胞的生长被抑制,细胞凋亡明显增加。Transwell检测各组A49和ACHN细胞的迁移能力发现,与si RNA转染对照组相比,HMGB1-si RNA转染组和s RAGE处理组细胞迁移能力降低,HMGB1过表达载体组细胞细胞迁移能力上调。2.HMGB1的干扰、过表达和s RAGE影响A498和ACHN细胞中LC3、Beclin1、RAGE和HMGB1蛋白的表达。采用Western blot和qRT-PCR检测A498和ACHN各组细胞中LC3、Beclin1、RAGE和HMGB1的m RNA表达水平,发现与si RNA转染对照组相比,HMGB1-si RNA转染组LC3、Beclin1、RAGE和HMGB1蛋白的表达量显著降低;与空载载体对照组相比,HMGB1过表达载体组LC3、Beclin1、RAGE和HMGB1蛋白的表达量显著上调;与s RAGE处理组相比,HMGB1-Vec+s RAGE组LC3、Beclin1、RAGE和HMGB1蛋白的表达量显著上调。3.HMGB1的干扰和s RAGE的处理抑制A498和ACHN细胞共培养后HUVEC细胞中VEGF和VEGFR2 m RNA的表达,HMGB1的过表达促进A498和ACHN细胞共培养后HUVEC细胞中VEGF和VEGFR2 m RNA的表达。提示HMGB1的抑制可下调VEGF和VEGFR2表达,为肾癌介入治疗的目标提供了未来方向。【结论】质粒转染高表达HMGB1、si RNA干扰沉默HMGB以及s RAGE阻断HMGB1和RAGE的结合,可影响肾癌细胞存活率、凋亡、侵袭、自噬和血管生成能力。HMGB1结合RAGE可诱导细胞自噬,降低细胞凋亡,促进血管生成,增强肾癌细胞的增殖、迁移能力。HMGB1可能是一个潜在的肾癌诊断和治疗的靶点。