【摘 要】
：
目的:磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚基α（PIK3CA）基因在许多人类癌症中均发生突变,进而可以促进肿瘤细胞的增殖,但是其潜在机制仍不清楚。本文主要研究在结直肠癌HCT116细胞中,PIK3CA基因的H1047R位点发生点突变,HCT116细胞增殖能力变化的分子机制。首先,我们检测在PIK3CA基因突变后的HCT116细胞中,细胞增殖、凋亡等能力的改变,及其同谷氨酰胺代谢的关系。接下来,检测PIK3C
论文部分内容阅读
目的:磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚基α（PIK3CA）基因在许多人类癌症中均发生突变,进而可以促进肿瘤细胞的增殖,但是其潜在机制仍不清楚。本文主要研究在结直肠癌HCT116细胞中,PIK3CA基因的H1047R位点发生点突变,HCT116细胞增殖能力变化的分子机制。首先,我们检测在PIK3CA基因突变后的HCT116细胞中,细胞增殖、凋亡等能力的改变,及其同谷氨酰胺代谢的关系。接下来,检测PIK3CA突变后PI3K-AKT、PI3K-PDK1、PI3K-MEK等信号转导通路如何影响GPT2的表达。进而,使用不同抑制剂作用于PIK3CA突变的HCT116细胞,检测细胞增殖、凋亡能力的改变。最后,以PIK3CA突变的HCT116细胞在裸鼠体内构建肿瘤模型,通过动物实验观察各抑制剂单用或者联用在体内对该肿瘤的抑瘤效果。通过上述研究,阐明PIK3CA突变影响HCT116细胞增殖的信号通路,同时利用信号转导分子抑制剂靶向阻断这些信号转导通路,以抑制肿瘤细胞的增殖,从而为临床上结直肠癌的治疗提供一种更为新颖有效的策略。方法:（1）使用CRISPR/Cas9方法构建PIK3CA H1047R位点突变的HCT116细胞（MUT细胞）。（2）通过Western Blot方法和RT-PCR检测构建的MUT细胞中PIK3CA和GPT2的蛋白含量。（3）通过CCK-8或流式细胞术检测MUT细胞的谷氨酰胺依赖性特征。（4）应用PI3K抑制剂作用于MUT细胞,通过Western Blot方法检测MUT细胞中PIK3CA相关信号通路关键蛋白的变化情况。（5）通过Western Blot方法检测HCT116细胞和MUT细胞中P-Rex1表达变化情况,及分别加入不同抑制剂对其表达的影响。（6）应用PI3K、MEK、PDK1、MEK+PDK1抑制剂分别作用于MUT细胞,通过CCK-8和流式细胞术检测各个抑制剂对MUT细胞的增殖和凋亡的影响。（7）观察裸鼠体内HCT116细胞和MUT细胞成瘤情况、增殖能力及裸鼠生存期。（8）于裸鼠体内应用PI3K、MEK、PDK1、MEK+PDK1抑制剂,观察对各组MUT细胞的抑瘤效果及裸鼠生存期。结果:（1）检测出构建的MUT细胞中PIK3CA的m RNA和蛋白表达水平增高,GPT2的m RNA和蛋白表达水平同样增高（P<0.05）。（2）正常条件培养时,MUT细胞较HCT116细胞增殖增快（P<0.05）;低血清环境下,HCT116细胞凋亡增加更迅速（P<0.05）。（3）去除谷氨酰胺时,MUT细胞增殖能力降低,凋亡明显较HCT116细胞增加（P<0.05）。（4）应用PI3K、MEK、PDK1、AKT抑制剂作用于MUT细胞,检测PIK3CA相关信号通路关键蛋白ATF4、GPT2表达水平下降（P<0.05）。（5）MUT细胞中P-Rex1蛋白表达增加（P<0.05）,加入PI3K抑制剂降低其表达（P<0.05）,加入PDK1或MEK抑制剂时对其表达无明显影响。（6）PI3K、MEK、PDK1、MEK+PDK1抑制剂对MUT细胞的增殖有明显抑制作用,凋亡明显增加（P<0.05）。（7）裸鼠体内MUT细胞成瘤生长明显快于HCT116细胞,且生存期更短（P<0.05）。（8）接种MUT细胞的裸鼠分别应用PI3K、MEK、PDK1、MEK+PDK1抑制剂后,单独使用MEK抑制剂和联合应用抑制剂组明显抑制肿瘤生长,抑瘤效果较好（P<0.05）,裸鼠生存期长,但PDK1抑制剂组抑瘤效果不好,与对照组无明显差异。结论:1.PIK3CA突变使HCT116细胞的增殖能力增强,且其增殖更依赖于谷氨酰胺。2.突变的PIK3CA可以通过信号转导分子MEK和PDK1促进GPT2的表达,从而促进MUT细胞的增殖。这说明突变的PIK3CA是籍由PI3K-MEK/PDK1双信号途径上调GPT2的表达,进而导致细胞增殖能力增强。其中,PI3K-MEK-GPT2通路是一条未经报道过的影响谷氨酰胺代谢的新通路。3.上述信号通路可被PDK1抑制剂或MEK抑制剂所阻断,进而在体内外抑制MUT细胞的增殖,而且MEK和PDK1抑制剂的联合应用可最为有效抑制MUT细胞的增殖。值得注意的是,在裸鼠体内,MEK抑制剂可以有效抑制MUT肿瘤的生长,但PDK1抑制剂则没有这样的作用,这可能提示我们在动物体内,同PI3K-PDK1-GPT2通路相比,PI3KMEK-GPT2通路对MUT肿瘤的生长具有更为重要的作用。
其他文献
目的:采用免疫荧光法和Western Blot法检测前列腺癌细胞LNCa P表面IGF-1R蛋白含量;制备以前列腺癌细胞LNCa P表面IGF-1R为靶点的靶向超声造影剂,并通过建立载人前列腺癌移植瘤裸鼠模型,对前列腺癌移植瘤进行体内超声显影的实验研究。方法:（1）实验一中分别培养正常前列腺上皮细胞RWPE-2和前列腺癌细胞LNCa P,用免疫荧光法对前列腺癌细胞LNCa P表面IGF-1R蛋白进
目的:探讨在食管癌患者的治疗中采用单孔充气式纵隔镜联合腹腔镜所能取得的手术治疗效果及安全性。方法:该回顾性研究搜集我院胸外科2019年3月1日至2020年12月31日的收治的食管癌患者信息,其中共纳入32例采用单孔充气式纵隔镜联合腹腔镜食管癌根治术的患者,分为A组,以及从同时期接受腔镜Mckeown术式的患者中纳入32例患者,分为B组。记录两组患者的术前一般基线资料,观察术后指标包括手术并发症、胸
目的:探讨超声多模态技术在甲状腺结节临床诊断中的应用价值,为提高甲状腺结节的诊断效能提供有效检查方法。方法:通过对在我院甲乳外科接受手术治疗的78例患者,共计81个结节依次进行常规超声检查、TI-RADS分级、剪切波弹性成像技术及US-FNAB,并获得病理结果,其中良性甲状腺结节16例,恶性甲状腺结节65例。所有患者必须先行常规超声检查,依据甲状腺影像数据报告与评分体系（TI-RADS）的各项评价
目的:完全腹腔镜肾输尿管全长切除术（CTLNU）与后腹腔镜联合下腹部小切口半尿路切除术（RLNU）进行对比,探讨CTLNU术式的疗效以及术者舒适程度,为临床治疗提供参考依据。方法:收集我院2018年8月至2020年12月收治的术后证实为上尿路上皮癌的患者,根据手术方式不同分为CTLNU组和RLNU组。通过统计两组患者信息进行比较,包括性别、年龄、既往病史、体重指数（BMI）、病变部位等一般情况以及
目的:采用多种生物信息学方法筛选食管鳞状细胞癌（ESCC）中的关键枢纽基因,并检测其中的关键基因IFI44L的生物学功能及分析与临床病理资料的相关性,从而可能为ESCC的诊治提供新的分子标志物,以期为食管鳞状细胞癌的临床诊疗提供新的理论依据。方法:从GEO数据库下载GSE17351,GSE75241,GSE100942,GSE106185这4组基因芯片,使用batch Normalize程序包对合
背景:慢性髓细胞白血病（Chronic myeloid leukemia,CML）是源发于骨髓造血系统的一种恶性肿瘤性疾病,呈全球性分布,在我国中位发病年龄较西方年轻。其主要是由于特征性的BCR-ABL融合致癌基因的形成以及具有强酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白引起致病。目前首选的治疗药物为酪氨酸激酶抑制剂TKIs,在临床上取得非常好的疗效,但同时也面临一些新的挑战。其中由于慢性髓细胞治疗药
目的:通过分析食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）中gankyrin和c-myc蛋白的表达,进一步研究这两种癌蛋白与不同的临床特征之间的关系,以期探讨其在ESCC中发生、发展、转移中的所起的作用,并为ESCC的诊断和治疗提供了依据。方法:回顾性搜集2017年6月至2020年8月收住于皖南医学院第一附属医院弋矶山医院放疗科的食管鳞癌（ESCC）患
目的:本研究分析甲状腺良恶性结节的超声征象,探讨超声对于甲状腺良恶性结节的鉴别诊断价值,为甲状腺结节诊断和治疗方法的选择提供帮助。方法:选取2015年01月01日-2020年01月01日近5年在皖南医学院弋矶山医院行甲状腺手术治疗的1749例患者,经术前的超声检查及手术病理检查证实。回顾性分析甲状腺良恶性结节的一般病历资料（年龄、性别等）,重点研究了甲状腺良恶性结节超声影像学征象,比较甲状腺良恶性
目的:探讨初诊多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）伴髓外病变（extrame dullary disease,EMD）患者的临床特征、预后及影响因素,并分析硼替佐米为基础的治疗方案对患者预后的影响。方法:研究纳入2014年1月1日至2020年12月31日皖南医学院弋矶山医院血液内科收治的多发性骨髓瘤患者108例,其中37例初诊时伴髓外病变（A组）,71例为不伴有髓外病变（B组）。
目的:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。具有预测乳腺癌患者生存期或帮助制定治疗决策的潜力生物标志物,其在治疗和预后方面具有的异质性对于个体化治疗至关重要。因此,积极深入研究有关乳腺癌早期发病机制及预后影响因素,寻找对于乳腺癌早期诊断、治疗、预后的潜在新的治疗靶点已成为当下临床研究的一个热点问题。本文基于公共数据库,旨在寻找可作为乳腺癌生物标志物的mRNA。方法:利用TCGA和GEO的转录组测序数据做差