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铜是植物生长发育必需的微量元素,在植物生理活动中发挥关键作用。植物在长期进化过程中产生了一套完整的铜稳态调控网络,铜伴侣蛋白是重要的参与者。铜伴侣蛋白能够结合铜离子并将其转运至靶蛋白。拟南芥CCH(copper chaperone)是第一个被鉴定的植物铜伴侣蛋白。本研究在前期研究基础上,构建了小黑杨PnCCH6、PnCCH7、PnCCH15和PnCCH17基因瞬时表达载体和两类植物表达载体。通过瞬时转化毛果杨原生质体研究了 PnCCH6、PnCCH7、PnCCH15和PnCCH17蛋白的亚细胞定位。利用构建的PnCCH7和PnCCH17基因的植物表达载体,通过蘸花法转化拟南芥野生型、cch和atx1突变体,获得了 T3代转基因植株并进行了生理指标测定。通过叶盘法遗传转化小黑杨,获得了转PnCCH7和PnCCH17基因的抗性植株。主要研究结果如下:(1)利用已克隆的PnCCH6、PnCCH7、PnCCH15和PnCCH17基因,通过酶切连接法构建了瞬时表达载体pBS-PnCCHs-GFP,并转化毛果杨茎原生质体。荧光显微镜观察结果表明,PnCCH6、PnCCH7蛋白定位于细胞膜、细胞质和细胞核,PnCCH15和PnCCH17蛋白定位于细胞膜和细胞核。(2)构建了 PnCCH6、PnCCH7、PnCCH15和PnCCH17基因的过量表达载体pCAMBIA1302-PnCCHs,获得了含有重组质粒的农杆菌GV3101菌株。利用构建的PnCCH7和PnCCH17基因的过量表达载体,遗传转化拟南芥野生型、cch突变体及atx1突变体植株,获得了 WT-PnCCH7和WT-PnCCH17的T1代种子及cch-PnCCH7、atx1-PnCCH7、cch-PnCCH17、atx1-PnCCH17的T3代种子。对cch-PnCCH7、atx1-PnCCH7、cch-PnCCH17、atx1-PnCCH17的T3代植株进行鉴定并筛选了 PnCCH7和PnCCH17基因大量表达的拟南芥转基因株系(cch-PnCCH7的3、5、9号株系,atx1-PnCCH7的-3、4、7 号株系,cch-PnCCH17 的 4、9、10 号株系,atx1-PnCCH17 的 2、6、8号株系)。(3)利用含有不同浓度铜离子(0、0.5、35 μmol/LCuSO4)的1/2霍格兰德营养液处理拟南芥野生型(WT)、cch突变体、atx1突变体及转基因株系幼苗5d,测定处理后拟南芥叶片的抗氧化酶酶活及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。结果显示,三种浓度铜离子处理后,cch突变体及atx1突变体植株的MDA含量显著高于WT植株,表明与WT植株相比,两种突变体植株在铜处理条件下受到了更严重的氧化损伤。缺铜处理时,cch-PnCCH17转化株系的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性显著高于cch突变体,cch-PnCCH7、cch-PnCCH17及atx1-PnCCH17株系的过氧化物酶(peroxidase,POD)活性显著低于相应的突变体;WT植株、cch-PnCCH17转化株系的过氧化氢酶(catalase,CAT)活性显著高于cch突变体植株。高浓度铜离子处理后,WT植株、cch-PnCCH7转化株系的POD活性显著高于cch突变体,cch-PnCCH7、atx1-PnCCH7、atx1-PnCCH17转化株系的CAT活性显著高于相应的突变体植株。此外,三种浓度铜离子处理后,拟南芥cch-PnCCH7、atx1-PnCCH7、cch-PnCCH17、atx1-PnCCH1-7转化株系的MDA含量显著低于相应的突变体植株。上述结果表明,PnCCH7和PnCCH17在一定程度上增加了拟南芥cch和atx1突变体的抗氧化能力。(4)构建了 PnCCH6、PnCCH7、PnCCH15和PnCCH17基因过量表达载体pROKII-PnCCHs,电击法转化农杆菌EHA105菌株后获得了含有重组质粒的农杆菌菌株。利用构建的PnCCH7和PnCCH17基因的过量表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法遗传转化小黑杨野生型植株,使用含有卡那霉素的培养基进行筛选,获得了 10株PnCCH7基因过量表达的小黑杨抗性植株,8株PnCCH17基因过量表达的抗性植株。