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R-(+)-4-氯-3羟基丁酸乙酯(Ethyl R-4-chloro-3-hydroxybutyrate,(R)-CHBE)是L-肉毒碱、阿伐他汀钙和(R)-γ-氨基-β-羟基丁酸(GABOB)等多种药物合成的重要手性中间体,具有重要的应用价值。 由于酶催化还原COBE获得(R)-CHBE的过程需要辅酶NADPH参与,为了实现辅酶再生,本文首先从赭色抛孢酵母细胞中克隆到了醛基还原酶(NADPH-dependent aldehyde reductase, ALR)基因,并且从巨大芽孢杆菌中克隆出6-磷酸葡萄糖脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,gdh223)基因,构建了具有高还原速率和手性选择性的重组大肠杆菌E. coli M15(pQE30-ALR-gdh223)。优化其还原反应条件,结果表明,100g/L重组菌在32℃,以150mM的葡萄糖为辅助底物的缓沖溶液(pH6.0)中能将30mM的4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)还原为(R)-CHBE,产物得率为92.5%,对映体过量值(e.e.值)为99%。当提高底物浓度达到90mM时,发现单相反应过程存在比较严重的底物抑制,产率降为30%。底物分批加入可以部分解除底物抑制,但产物抑制作用仍然存在。 为减轻产物抑制的影响,研究了重组菌在两相体系中不对称还原反应,并优化其还原反应条件。结果表明,在水/乙酸丁酯两相体积为1:1的体系中,32℃时在添加150mM葡萄糖的缓沖溶液中,反应时间为4h,100g/L的重组菌能将90mM的COBE还原为(R)-CHBE,产物得率为74%,e.e.值为99%,明显高于水相的30%。 此外,还研究了在水/乙酸丁酯两相体系中,利用能分别表达羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的重组菌M15(pQE30-ALR)和重组菌M15(pQE30-gdh223)进行双菌耦合不对称还原的反应条件。结果表明,在水/乙酸丁酯的体系中,32℃时在pH 6.0的缓冲溶液中,100g/L的重组菌(M15(pQE30-ALR)/M15(pQE30-gdh223)=4/1)在滴加底物条件下将360mM的COBE还原为(R)-CHBE,产物得率为78.5%,e.e.值为87%。 实验结果表明,利用此两种方法进行COBE的手性还原,均不需要额外添加昂贵的辅酶,解决了辅酶再生的问题,使微生物法生产(R)-CHBE向工业应用目标又前进了一步。