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天冬氨酸蛋白酶是一类以天冬氨酸残基为催化活性位点,在酸性pH条件下有活性的蛋白水解酶,参与机体许多重要的生物学过程。鸡cathepsin E-A-like是一种新发现的天冬氨酸蛋白酶家族成员,由于其氨基酸序列和蛋白质结构与斑马鱼nothepsin极为相似,故也称为鸡“similar to nothepsin”,虽然本实验室以及其他人的前期研究表明,鸡cathepsin E-A-like基因在产蛋期显著升高,但有关该基因的功能和调控机制依然不明确。本研究以探究鸡cathepsin E-A-like基因的时空表达特征和调控机制为目的,首先对鸡cathepsin E-A-like基因的CDs序列进行了克隆和生物信息学分析;然后采用实时荧光定量PCR技术对cathepsin E-A-like基因在鸡不同组织的时序表达规律进行了研究;最后,以雌激素及雌激素受体拮抗剂处理的青年母鸡和鸡胚肝脏原代细胞为模型,研究了鸡cathepsin E-A-like基因的调控机制。所得到的主要试验结果如下:1.参考NCBI中预测的鸡cathepsin E-A-like基因序列设计引物,以30周龄鸡的肝脏cDNA为模板,克隆获得cathepsinE-A-like基因全长1215 bp的CDs序列(Genbank:KR559732),序列分析表明,该基因可编码一个由404个氨基酸残基组成的蛋白质。2.应用NCBI中的BLASTp软件,将cathepsin E-A-like氨基酸序列在鸡的基因数据库中进行BLAST比对,然后采用Clustal X2对一致性高的氨基酸序列进行多重比对和保守性分析,结果表明,鸡cathepsin E-A-like与鸡cathepsin D和cathepsin E氨基酸序列的一致性较高,分别为45%和49%,且具有两个保守的天冬氨酸蛋白酶活性位点。利用SMART和Prosite软件对cathepsin E-A-like氨基酸序列的结构域和功能位点分析表明,cathepsin E-A-like具有天冬氨酸蛋白酶的典型结构,即信号肽,A1-Propeptide和Asp功能结构域。3.cathepsin E-A-like基因的系统发育树和共线性分析表明,cathepsin E-A-like基因与nothepsin基因为直系同源基因4.对10周龄和30周龄卢氏绿壳蛋鸡的14种组织进行实时荧光定量PCR检测,结果表明,cathepsin E-A-like基因在肝脏组织中特异表达;进一步对1日龄、1周龄、10周龄、20周龄、30周龄和35周龄鸡的肝脏组织进行实时荧光定量PCR检测发现,该基因只在30和35周龄产蛋鸡的肝脏中有表达。综上表明,cathepsin E-A-like基因的表达具有组织和时序特异性,推测cathepsin E-A-like基因可能受到鸡体内雌激素的调控。5.为了分析鸡cathepsin E-A-like基因的表达调控机制,用不同浓度的17β-雌二醇处理10周龄青年母鸡和鸡胚肝脏原代细胞,结果表明,雌激素能够显著诱导鸡cathepsin E-A-like基因表达上调。6.为了进一步研究雌激素调控鸡cathepsin E-A-like基因表达的机制,用17β-雌二醇分别与雌激素受体拮抗剂MPP(ER-α的高度选择性拮抗剂)、ICI 182,780和tamoxifen(ERα和ERβ受体的拮抗剂,tamoxifen有兴奋GPR30的作用)共处理鸡胚肝脏原代细胞,结果表明,17β-雌二醇分别与ICI182,780和Tamoxifen共处理肝细胞时cathepsin E-A-like的表达水平显著低于17β-雌二醇单独处理肝细胞时的表达水平时(P<0.05),而与对照组之间无显著差异,说明雌激素是通过ERβ介导调控鸡cathepsin E-A-like基因的表达。综上所述,鸡cathepsin E-A-like基因与早期在鱼类等低等脊椎动物发现的nothepsin基因是直系同源基因,在产蛋鸡肝脏中特异表达,且其表达是雌激素通过ERβ介导调控的。