论文部分内容阅读
目的:通过三维细胞培养(TDCC)技术获得卵巢癌细胞A2780的多细胞球体(MCS),观察不同成分氨基酸溶液和不同种类脂肪酸溶液对MCS生长的影响,以及不同种类脂肪酸对顺铂化疗效果的影响,为确定卵巢癌病人营养治疗方案提供基础资料。
方法:
1.用琼脂糖凝胶铺底,以无血清RPMI 1640为培养液,静置状态下培养卵巢癌细胞A2780,获得卵巢癌MCS。
2.分别用平衡氨基酸和增量精氨酸、去蛋氨酸、去缬氨酸、复合氨基酸(增量精氨酸+去蛋氨酸+去缬氨酸)4种不平衡氨基酸作用于MCS,Radial Outgrowth法观察MCS生长变化,流式细胞仪分析细胞周期,RT-PCR法检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。
3.分别用不同浓度的中链脂肪酸(MCFA)复合物和长链脂肪酸(LA)亚油酸(linoleic acid,LA)作用于卵巢癌MCS,MTT法观察不同作用时间下细胞抑制率的变化,并求出两种脂肪酸的IC<,50>;将MCFA和LA分别与不同浓度的顺铂混合后作用于MCS,台盼蓝染色观察联合用药时细胞抑制率的变化;分别用顺铂、MCFA、LA、MCFA+顺铂以及LA+顺铂作用于MCS,流式细胞仪分析细胞周期和细胞凋亡情况,Westernblotting检测增殖细胞相关抗原KI67的表达。
结果:
1.使用改进的TDCC方法培养卵巢癌细胞A2780后成功获得MCS;培养5天后,MCS外观呈明显球形,大多数直径为50μm左右。
2.培养MCS至第6天时,平衡氨基酸溶液作用的MCS细胞生长距离可达63.08+4.07μm,与其它各组相比差异具有统计学意义(P<0.01);增量精氨酸组、去蛋氨酸组和去缬氨酸组的生长距离比较接近,差异没有统计学意义(P>0.05);
复合组MCS生长距离为21.55±1.20μm,明显小于其他不平衡氨基酸组,差异具有统计学意义(P<0.05)。 3.流式细胞仪分析结果显示,平衡氨基酸溶液作用的MCS细胞多处于增殖期(46.3±4.0)%,不平衡氨基酸溶液作用的MCS细胞多处于G0/G1期,其中复合组MCS处于G0/G1期的细胞数量为(77.6±4.7)%,处于S期的细胞数量为(13.2±2.2)%,与其他各组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。PCNA表达结果也显示,平衡氨基酸组PCNA的表达水平最高,而复合组的表达水平最低。
4.MCFA和LA都可以使MCS细胞存活率下降,细胞抑制率随作用时间的延长和脂肪酸浓度的增加而增加。作用72h时,MCFA的IC<,50>为0.10%,而LA组为(0.50%),差异具有统计学意义(P<0.05)。
5.MCFA、LA分别与不同浓度顺铂合用,MCS细胞存活率有不同程度下降。当顺铂浓度为10.μmol/L时,MCFA作用的MCS细胞的抑制率为(51.60±4.83)%,与LA组((42.97±3.39)%)相比,差异有统计学意义(P<0.05);与单纯使用顺铂的对照组((30.27±4.53)%)相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。
6.MCFA、LA分别与顺铂合用后,MCFA+顺铂组MCS细胞大多处于G0/G1期((70.2±5.3)%),与LA+顺铂组((68.3±4.5)%)相比,差异具有统计学意义(P<0.05);MCFA+顺铂组、LA+顺铂组分别与顺铂组相比,差异也具有统计学意义(P<0.05)。KI67表达结果也显示,MCFA+顺铂组MCS细胞KI67的表达水平较LA+顺铂组低。
结论:平衡氨基酸可以促进卵巢癌MCS细胞生长,促进细胞进入增殖期;不平衡氨基酸可以抑制卵巢癌MCS细胞生长,阻滞肿瘤细胞进入增殖期,而使其大量停留在G0/G1期。在不平衡氨基酸中,复合氨基酸的抑制作用比调整单一成分的不平衡氨基酸(增量精氨酸组、去蛋氨酸组、去缬氨酸组)较强,后三者抑制卵巢癌MCS的作用没有统计学差异(P>0.05);MCFA和LA均可以阻滞卵巢癌MCS细胞进入增殖期,使其大量停留在G0/G1期,从而抑制卵巢癌MCS细胞生长,其中MCFA的作用较LA强。 3.MCFA和LA分别与顺铂合用时,可以阻滞卵巢癌MCS细胞进入增殖期,抑制MCS细胞生长,诱导MCS细胞凋亡,从而增强卵巢癌MCS细胞对化疗药物顺铂的敏感性。其中MCFA的作用较LA强。