论文部分内容阅读
背景与目的目前临床上救治危重患者的重要措施之一是机械通气(mechanical ventilation, MV),及早对患者进行机械通气不但可以纠正难治性低氧血症,而且对防治肺泡塌陷以及对抗肺水肿也具有重要作用。但是机械通气也伴随着许多并发症,如机械通气相关性肺损伤(ventilation-induced lung injury, VILI),目前越来越多的研究人员对此并发症高度关注。参与VILI的细胞种类有不少,研究较多的有中性粒细胞、毛细血管内皮细胞、肺泡上皮细胞等,而目前的研究热点是VILI中肺泡巨噬细胞(Alveolar macrophages, AM)所产生的作用。有研究发现,在生理情况下AM分泌的细胞因子的种类和数量都十分有限,但在潮气量通过机械牵张导致肺损伤(即伤害性机械通气)的病理情况下,AM活化后可分泌大量的炎性细胞因子、趋化因子、炎性介质等多种生物活性物质而导致肺损伤。本文中研究的TLR4便是主要存在于哺乳动物肺脏的巨噬细胞表面,它是Toll样受体家族的成员之一,是重要的固有免疫分子。由于在体实验受神经体液等多种因素的调节,单纯的机械牵张对大鼠肺泡巨噬细胞上TLR4受体的影响尚不是很清楚。我们的实验目的在于探讨机械牵张对大鼠AM Toll样受体4(TLR4)表达的影响。方法用预冷的无菌的PBS-H(10%小牛血清的PBS和含10U/ml肝素)对大鼠进行支气管肺泡充分灌洗,然后将肺泡灌洗液中的AM进行分离和纯化,最后收集的贴壁细胞便是AM。本实验将培养后的AM随机分为3组(n=6)：机械牵张6h组、机械牵张8h组和静止对照组。机械牵张组细胞采用美国Flexercell公司生产的Flexercell4000TTM应力加载系统,施加的牵张力大小为能够使变形膜拉伸30%,牵张频率为30次/min,牵拉：松弛=1：1,牵张时间分别为6h和8h。静止对照组细胞除了未施加周期性牵张外,其余条件均同牵张8h组。逆转录酶PCR (reverse transcriptase PCR, RT-PCR)检测AM上的TLR4mRNA的表达；ELISA检测巨噬细胞炎性蛋白2(macrophage inflammatory protein2, MIP-2)的浓度；免疫细胞化学法检测AM上TLR4蛋白的表达。最后的数据用统计学进行处理。结果AM的TLR4RT-PCR结果用TLR4mRNA/ACTINmRNA的OD比值表示,与对照组比,机械牵张组TLR4mRNA条的表达差异有统计学意义(P<0.01),机械牵张6h组与8h组表达差异无显著性；机械牵张组细胞培养液中MIP-2的浓度升高差异有显著性(P<0.01),机械牵张6h组与8h组浓度差异无显著性；AM的TLR4免疫细胞化学结果以实验组TLR4的吸光度值-阴性对照组TLR4的吸光度值(△TLR4)表示,与对照组比,牵张组/XTLR4的升高差异有显著性(P<0.01),机械牵张6h组与8h组的表达无统计学差异。结论机械牵张导致了大鼠肺泡巨噬细胞TLR4和MIP-2表达上调。