一、研究的背景和目的A20（tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3,TNFAIP3）基因是肿瘤坏死因子（TNF-α）诱导下的即早反应基因,其表达产物属于胞浆内的一种锌指类瞬时调控蛋白。研究发现,A20可抑制不同细胞因子（TNF-α、IL-1、NF-κB等）及基因活化引起的细胞凋亡、过度的炎症反应、免疫排斥、甚至可影响肿瘤的转归等。在成纤维细胞、B淋巴细胞、WEHI164细胞、NIH3T3细胞及内皮细胞中均发现A20蛋白可抑制TNF诱导的细胞毒作用。实验证明,A20基因缺陷小鼠在出生一周就显现明显的发育不全,很快出现严重的炎症反应及恶病质,对LPS及TNF高度敏感,并过早死亡。随着基因工程技术的不断发展,人工干预内源性基因表达的方法越来越多,如基因敲除与敲入、反义技术、核酶技术、人工转录因子（artificial transcription factor, ATF）、以及近期发展起来的RNA干扰技术等。不同技术的优缺点存在很大差别,如基因敲除,其技术手段先进,特异性强,但步骤烦琐,技术条件要求非常高,并非一般实验室容易开展。各种反义技术多是在基因转录后水平上进行调控,其作用往往限于抑制基因的表达,而且需要针对大量的靶标进行设计。ATF技术则是通过体外构建人工转录因子,入核后识别DNA上的特异性核酸位点,对特定基因的转录进行调控,因此利用少量的人工转录因子往往就能起到很好的调控效果。其作用效果不但能抑制或减弱特定基因的表达,也可以启动靶基因的过表达。一个合适的人工转录因子甚至可以调节某个基因家族或是整条代谢通路中的一系列相关产物,因此人工转录因子在基础研究、肿瘤等疾病的基因治疗与抗病毒治疗等领域都具有广泛的应用前景。转录因子通常由两个非常重要的结构域: DNA结合结构域（Binding Domain,BD）和效应结构域（Effecter Domain,ED）。前者具有与特定DNA结合的特性,后者则发挥效应作用。由于人工转录因子可以进行模块化设计,通过改变DNA结合结构域可以灵活选择其作用靶位,改变其效应结构域则可以对于目的基因进行激活、抑制、甲基化等不同的调控,应用十分灵活方便。实验证明,可把两类不同的结构域以模块形式在体外相互组合,构建新型的人工转录因子,进而调节相应基因的表达。在人工转录因子的设计过程中,构建能够识别特定基因序列的DNA结合域是最重要的工作。近年来,用锌指蛋白作为工具来调控哺乳动物特定基因表达的研究有了较大发展,研究方法主要是通过设计锌指蛋白中的DNA结合区域来识别特定的DNA序列,通常为特定基因的启动子序列,进而通过与其融合设计的效应域对该基因进行转录激活或抑制。研究证明,Cys2-His2锌指蛋白可作为DNA结合域的一种理想的结构框架。一般来讲,一个典型的锌指蛋白DNA结合域通常由3个或6个锌指组成。目前,人工锌指蛋白（artificial zinc finger protein, AZP）技术使人们可直接选择不同的DNA序列,从而设计出相应的DNA结合域。人类基因组计划所推动的大规模DNA测序,为生物医药工业提供了大量可用于新药开发的原材料。生物信息学为分子生物学家提供了大量对基因序列进行分析的工具,不但可以从资料的获取、基因功能的预测、药物筛选过程中的信息处理等方面大大加快新药开发的进程,而且可以大大加快传统的基因发现和研究,因而成为各赢利性研究机构和医药公司争夺基因专利的重要工具。人类基因组测序的推动者塞莱拉公司宣布,将集中精力挖掘蕴涵在基因序列中的信息,寻找制药的“靶点”。二、本研究的主要方法和结果:1.确定并克隆A20基因上游假定启动子序列:利用生物信息学手段对A20基因上游序列进行分析,显示A20基因上游-1000～+300序列系GC富集区,存在诸多反式作用因子结合元件,并确定基因组NC₀00006 138230088处碱基“C”为A20基因的TSS。利用Gene2Promoter数据包以及McPromoter服务器分析A20基因假定启动子范围,确定基因组NC₀00006 138229786～138230182间的序列作为A20基因的假定启动子研究序列。采用巢式PCR方法从人基因组DNA中克隆了A20基因假定启动子序列,亚克隆到pGL3载体中。通过双荧光素酶活性实验分析,证明获取的假定启动子序列具有启动子活性。2.设计可特异性结合A20基因上游启动子区的人工锌指蛋白ZFP:登陆Scripps的ZF tools服务器,提交获得的A20基因假定启动子序列,设定各种参数后,获得了A20基因上游特定靶序列及相应的人工锌指蛋白（zinc finger protein,ZFP）序列。利用不同生物软件及在线服务器对ZFP的理化性质,各级结构的特征进行了分析,并利用生物信息学手段对获得的ZFP进行分析及优化。3.检测ZFP在原核及真核细胞内的表达以及与A20基因假定启动子靶序列的结合活性:全基因合成ZFP核酸序列,并构建到不同的表达载体中。转染大肠杆菌及COS7细胞,分别利用RT-PCR、SDS-PAGE、Western Blot、EMSA等手段观察ZFP的表达情况及生物学活性。结果显示ZFP可分别在大肠杆菌及COS7内有效表达并具有相应的生物学活性。4.人工转录因子ATF的构建、表达及活性分析:ATF结构包括:DNA结合结构域（人工锌指蛋白ZFP）、效应结构域（NF-κB亚基P65蛋白的激活域）、核定位信号（Nuclear localization signal,NLS）以及Flag Tag。脂质体转染ATF表达质粒到ECV304细胞,分别应用免疫细胞学方法、RT-PCR、Western Blot、荧光素酶活性分析及EMSA检测ATF融合蛋白的表达及生物学活性。结果显示ATF在ECV304细胞中可正常表达,并且在NLS引导下能够完成入核过程;EMSA结果显示,ATF能够特异性结合目标靶序列;荧光素酶活性实验显示,ATF可有效启动下游基因的表达。5.ATF人工转录因子诱导A20基因的表达及抑制细胞凋亡的作用:ATF重组质粒转染ECV304细胞,观察ATF启动A20基因的表达情况。并观测在内毒素刺激条件下,ATF对ECV304细胞凋亡的作用。结果显示ATF可启动内源性A20表达,对内毒素诱导的细胞凋亡具有明显的抑制作用。三、结论使用生物信息学手段分析了A20基因上游序列,确定了A20基因的TSS及假定启动子位置。A20基因的TSS位于人基因组NC₀00006 138230088处,其假定启动子位于人基因组NC₀00006 138229786–138230182。采用巢式PCR方法从人基因组中成功克隆了这一序列。通过双荧光素酶活性实验分析,证明克隆的假定启动子序列具有启动子生物学活性。利用ZF tools服务器,获得了人工锌指蛋白ZFP的蛋白序列。通过生物信息学方法优化获得了ZFP核酸序列。把全基因合成的ZFP序列分别亚克隆到不同载体上,构建了重组原核及真核表达载体并成功表达。结果显示利用生物信息学手段设计的人工锌指蛋白可在原核及真核细胞内正常表达,并具有相应的生物学活性。以ZFP为DNA结合域、P65蛋白的激活区为效应域构建了人工转录因子ATF。实验显示ATF可正常表达并具有相应的生物学活性。ATF可启动ECV304细胞中内源性A20基因的表达。ATF对内毒素诱导的细胞凋亡具有明显的抑制作用。