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【背景】肿瘤的多药耐药（multidrug resistance，MDR）现象是导致化疗失败的主要因素，也是影响患者生存的主要因素。我们在研究胃癌多药耐药机制中通过抑制消减杂交技术发现，朊蛋白（Prion protein，PrP）和核糖体蛋白L6（Ribosomal protein L6，RPL6）在胃癌多药耐药细胞系SGC7901／ADR中高表达。PrP是近年来的研究热点之一，它是一种糖蛋白，在核糖体合成，转运到内质网折叠，运输到高尔基体进行糖基化修饰，最后到达细胞膜，与Caveolin、PGIS（prostacyclin synthase）及P-gp（P-glycoprotein）等共同组成CLDs结构域（caveolae-like membrane domains）。另外，PrP也与laminin、37-kDa／67-kDa laminin receptor共同组成蛋白质复合单位，在神经元的增殖分化、粘附、生存与凋亡、信号传导等生理病理功能方面发挥着重要作用。PrP包括两种形式：细胞型（the normal or cellular form of prion protein，PrPc即朊蛋白）和异常型(the pathogenic or scrapie form of prion protein，PrPsc即朊病毒)。PrPc与PrPsc的性质完全不同，PrPc是机体组织细胞的正常成分，PrPsc则可以通过胁迫PrPc畸变而进行自我复制，象病毒一样具有遗传性、致病性、传染性和复制能力。目前对PrP的研究仍限于神经系统，即使是基因敲除鼠的研究也只限于神经系统，而对其神经系统外的功能却所知甚少。我们的研究不仅对揭示其神经系统外的功能，认识PrP这种特殊性质的蛋白质具有重要的意义，而且从一个新的角度探讨胃癌恶性转化的机制，找到新的调控靶点，为进一步阐明胃癌恶性转化及发生发展规律奠定理论基础，并为胃癌恶性表型的逆转寻找新的途径。 RPL6是我们研究的另一个在胃癌耐药细胞中高表达的基因。核糖体蛋白除组成核糖体，参与蛋白质的生物合成之外，还具有其他功能。资料显示，核糖体蛋白L6（Ribosomal protein L6，RPL6）位于核糖体50S的大亚基中，定位于氨酰 第四年医大学俗士研纪生论文一 tRNA结合位点，肽酞转移酶中心区。基因全长为959hP，分子量为33417，编码288个氨基酸。目前人们对RPL6的研究资料并不很多，更未发现其与胃癌的MDR有关。我们的发现无疑对研究核糖体蛋白的核糖体外功能具有重要的意义，也对进一步阐明胃癌的MDR机制奠定理论基础。 【目的】1．PrP和RPL6基因在多种肿瘤组织和消化系统肿瘤细胞系中的差异表达；2．PrP和RPL6在胃癌组织和细胞中差异表达的意义——与胃癌多药耐药性的相关性；3．PrP和 RPL6介导胃癌多药耐药性的作用机制及其对MDR的逆转。4．PrP和 RPL6的交互作用。 【方法】（1）以分子克隆技术由 SGC7901细胞系中克隆出 PrP和 RPL6基因；（2）利用 Northern blot、RT－PCR和 Western blot检测 PrP和 RPL6在 RNA和 Protein水平的差异表达；（3）将测序证实的PrP和 RPL6基因克隆入pCDNA3．二／VS－His B中构建正义和反义真核表达载体，将正义表达载体转染入SGC7901，反义表达载体转入SGC7901／ADR，G418进行转染细胞的稳定筛选并克隆化，转染细胞的RNA和Protein水平的鉴定；（4）利用PrP对蛋白酶的不同反应特性进行PrP存在形式 的鉴定；（5）PrP和RPL6与胃癌多药耐药性的相关性的研究：利用所获得的转染正义和反义PrP和RPL6基因的细胞系，通过MTT实验进行体外药物敏感性分析，计算细胞对药物的K。。值和耐药指数（resistance index，RI）、并进行SRCA正常免疫力小鼠体内药物敏感性实验；（6）PrP和 RPL6基因对细胞膜药物转运的影 响：利用流式细胞仪检测细胞内阿霉素的蓄积和滋留，并以此计算细胞膜的药物 泵出率；（7）借助 Western blot、DNA Ladder及 PI染色等方法检测与细胞凋亡的 关系；（8）流式细胞仪对基因转染细胞及其对照细胞进行细胞周期分析，并计算细 胞的增殖指数（pr。hf。r。nsfndex，PI），绘制细胞生长曲线；（9）western UOt 和Verapamil阻断实验检测PrP和RPL6与P－rP的相关性：侧利用Westernblot 和阻断实验检测PrP与COX－2和Caveolin－豆的关系；朋 iestern blot方法检测 其它信号分子的相关性；OD利用 Western blot和流式细胞仪检测 PrP和 RPL6是 一4 一 第四军医大用俗士研兑生论文否存在着直接的交互作用；QD 特异性PrP 的基因干扰（dsRNA－mediatedinterference，RNAi）一RNAi载体的构建及相应的检测；Q4生物化学方法检测PrP’与过氧化损伤系统的相关性；Qg Western blot和细胞粘附一耐药实验检测PrP与 Laminin家族及其与 CAM－DR（细胞粘附介导的耐药，cell adhesion meiateddrug resistance）机制的相关性；恤免疫组化和共聚焦显微镜方法检测PrP在胃、肝、肺、乳腺、膀肽、子宫等正常和癌组织及胃癌细胞系中的表达。 【结果】川 以 SGC7901细胞 cDNA为模板成功克隆 PrP和 RPL6基因，测序证实无误；① Northern blot、RT－PCR和Western blot证实 PrP和 RPL6在耐药细胞％C7901／肌R