转录因子调控辣椒素类物质形成的遗传和分子机制研究

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jianrui02
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辣椒素、二氢辣椒素及其类似物简称辣椒素类物质是辣椒属(Capsicum spp.)果实胎座中的一类特有异生代谢产物。辣椒素类物质赋予辣椒果实辣味,具有抵抗病原菌和食草动物损害辣椒果实的功能。辣椒素类物质在其他领域具有广泛的应用价值。辣椒基因组测序发现辣椒素合成途径相关基因在其近缘的茄科植物番茄和马铃薯中也存在。比较转录组学分析发现辣椒素合成途径关键基因在辣椒花后16天至绿熟期果实的胎座中高度表达,而在番茄和马铃薯中则微弱或不表达,暗示了辣椒素合成关键基因在辣椒中获得转录是辣椒属植物产生辣味的原因。然而,辣椒素合成途径相关基因在特异在辣椒属植物胎座被激活的分子机制尚不清楚。此外,辣椒素类物质含量高低和辣椒素合成相关基因著正相关,背后的转录遗传和分子机制尚不楚。本论文通过采用生理学、遗传学、生物信息学、生物化学和分子生物学等手段开展相关研究拟阐明了上述科学问题,取得结果如下:(1)采用高效液相色谱法(HPLC)分析了辣椒C.annuum和C.chinense不同发育时期胎座和果肉中辣椒素和二氢辣椒素的含量。结果表明,辣椒素和二氢辣椒主要在辣椒果实花后16天至35天合成,到45天达到积累高峰期。进一步分析了辣椒C.annuum,C.baccatum,C.chinense,C.frutescens和C.pubescens 5个栽培驯化种不同基因型材料花后45天胎座、果肉和整个果实的辣椒素和二氢辣椒素含量,结果表明辣椒素和二氢辣椒素含量在不同种间存在明显差异,同时同一个种内不同基因型材料辣椒素和二氢辣椒素含量也存在明显的差异。我们发现C.chinense种辣椒素和二氢辣椒素含量明显高于其他4个栽培驯化种,这主要是由于C.chinense种果肉中积累了大量的辣椒素和二氢辣椒素。辣椒素和二氢辣椒素作为辣椒素类物质主要成分,在不同基因型材料间含量的占比存在明显的差异。(2)采用辣椒素类物质含量高的740自交系(C.chinense)作母本,辣椒素类物质含量低的CA1自交系(C.annuum)作父本构建了种间杂交群体。采用高通量测序技术,运用简化基因组测序策略分析了150个F2单株的SNP情况,基于检测到的SNP开发了相应的SNP标记,构建了一个包含9038个SNP标记的高密度的遗传图谱。转录组测序和荧光定量PCR分析辣椒花后16天胎座相关基因表达情况,结果表明辣椒素合成途径相关基因在740自交系显著高于CA1自交系。分析了150个F2单株辣椒素和二氢辣椒素的含量,发现其含量在本研究的群体中呈现出正态分布的特点。结合高密度遗传图谱和辣椒素类物质含量的表型数据,采用复合区间作图法(CIM)将一个控制辣椒素类物质含量的主效位点Cap1定位到7号染色体,Cap1可以解释本研究群体37~42%表型变异。将本研究中150个F2群体中辣椒素类物质含量极端个体20个单株的测序数据混合,形成极端高低两个混池,采用BSA进行分析发现在Cap1位点存在大量的差异SNP,表明Cap1是本研究群体中控制辣椒素类物质含量的关键位点。(3)将Cap1位点精细定位到510 kb的范围,发现该区域包含6个编码产物为MYB家族转录因子的基因簇,其中有4个MYB转录因子序列同源性高达84%以上。共线性分析表明,其他茄科作物中该位点也存在2~4个同源的MYB转录因子。表达分析发现在这6个基因中只有1个基因在胎座中特异表达,在此命名为Cap1,并且其表达模式和辣椒素合成关键基因高度一致。然而,在其他茄科植物中和Cap1同源的MYB转录因子则不转录。进化分析表明Cap1属于茄科植物特有MYB转录因子。亚细胞定位和酵母自激活实验表明Cap1编码一个具有激活功能的核定位的蛋白。采用病毒诱导基因沉默(VIGS)、酵母单杂交、双荧光素酶报告系统、染色质免疫共沉淀等实验证实了Cap1编码的蛋白可以直接调控辣椒素合成途径相关基因参与辣椒素的生物合成。(4)表达分析发现Cap1转录水平和辣椒素类物质含量显著正相关。分析编码区发现SNP较少出现在Cap1编码蛋白的DNA结合区域和激活区域。Cap1基因启动子在5个栽培驯化种中存在大量的SNP和In Del变异。启动子活性分析表明起始密码子上游1102~1292是决定C.chinense种活性显著高于其他4个种的关键区域。分析发现在该区域内C.chinense种存在1个正常的W-box元件,然而在C.annuum,C.baccatum,C.frutescens和C.pubescens种中该W-box元件出现缺失或者SNP突变。进一步分析表明该W-box可以被1个胎座特异表达的WRKY9转录因子识别和结合进而被激活,使得C.chinense种的Cap1基因转录水平明显高于其他4个种,进而导致极辣C.chinense种辣椒的形成。
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