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菜心（Brassica rapa ssp.parachinensis）是我国华南地区具有较高经济价值的叶菜类蔬菜之一,口感清爽又含有丰富的植物蛋白、维生素和氨基酸等营养物质,因而备受消费者的青睐。然而,菜心采后叶片极易衰老黄化、萎蔫而失去商品价值,导致严重的经济损失。因此,深入研究菜心采后叶片衰老的调控机制,对生产上改进菜心采后品质保持技术措施,减少生鲜损耗具有重要意义。植物激素对叶片衰老具有重要的调控作用,并且不同植物激素通过形成交互（crosstalk）网络,协同或拮抗地调控着叶片的衰老过程。脱落酸（abscisic acid,ABA）、乙烯和茉莉酸（jasmonic acid,JA）是主要的衰老促进激素,而细胞分裂素（cytokinin）和赤霉素（gibberellins,GA）可以延缓叶片衰老。转录因子在植物激素交互网络中发挥着重要作用,其中植物特有的一类转录因子NAC是主要的衰老调控因子之一,可以通过影响ABA的合成来调控叶片衰老。本实验室前期研究发现外源GA处理可以延缓菜心采后叶片衰老,而ABA处理促进了叶片衰老;但菜心叶片衰老过程中,ABA和GA是否有交互,以及具体的机制,还不是很清楚。为此,本论文首先明确外源ABA诱导菜心采后叶片衰老过程中,内源ABA与GA的含量变化、及其合成代谢途径相关基因的表达变化;基于转录组测序（RNA-seq）筛选差异表达的转录因子,并重点关注NAC转录因子;通过凝胶阻滞分析（EMSA）、染色质免疫共沉淀-荧光定量PCR（Ch IP-q PCR）和烟草瞬时表达体系等明确4个NAC转录因子的靶基因及其转录调控效应,结合在拟南芥中稳定超表达,重点对其中1个NAC的生物学功能进行了分析和验证。主要的研究结果如下:1.采用100?M的外源ABA喷施菜心采后叶片,与对照相比,ABA处理后的菜心叶片衰老进程明显加快,表现为总叶绿素含量和叶绿素荧光Fv/Fm值显著下降,衰老标志性基因（Br SAG12）和叶绿素降解基因（Br NYE1、Br NYC1、Br NOL1、Br PPH1、Br PAO和Br RCCR）的表达水平也高于对照。与此同时,外源ABA处理也促进了菜心叶片体内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的积累及其合成基因（Br Rboh B和Br Rboh C）的上调表达。采用液质联用（LC-MS）测定了叶片内源ABA和GA含量,发现叶片衰老过程中内源ABA含量上升,而GA含量下降;外源ABA处理后明显增加了叶片内源ABA的积累,并促进了GA含量的下降。进一步分析发现,与对照相比,ABA合成基因（Br NCED3和Br ABA2）及GA降解基因（Br GA2ox1）在ABA处理后的叶片中的表达水平上升更快,表达量也更高;而ABA降解基因（Br CYP707A3）与GA合成基因（Br KAO2和Br GA20ox2）的表达水平在ABA处理后的叶片中却下降更快,表达量也更低。这些结果说明,外源ABA处理促进了ROS和内源ABA合成、叶绿素和内源GA降解;抑制了内源ABA降解和GA合成,引起内源ABA积累和GA含量下降,进而加速菜心采后叶片衰老。2.对对照0 d（0d）、对照3 d（CK3d）和ABA处理后3 d（ABA3d）等样品进行了高通量RNA-seq分析,以FDR<0.05,且|log2FC|>1为标准筛选差异基因,共获得12361个显著差异表达基因,其中显著上调的差异基因6316个,显著下调的差异基因6045个。对所有差异基因做GO功能分析和KEGG pathway分析,结果显示差异基因在植物激素合成代谢通路和信号转导途径上都有显著富集。在所有差异基因中,鉴定到898个转录因子,其中数量最多的是ERF,共100个,其次是NAC、b HLH、WRKY和MYB,分别有87、78、74和69个。进一步通过RT-q PCR验证,从所有差异表达的NAC中挑选出外源ABA显著诱导的4个NAC转录因子,序列分析显示它们分别与拟南芥的ANAC041/ANAC055/ANAC087/ANAC092同源性最高,因此命名为Br NAC041、Br NAC055、Br NAC087和Br NAC092。亚细胞定位实验结果显示它们都定位在细胞核,酵母和烟草体内转录活性分析实验表明Br NAC041具有转录抑制活性,而Br NAC055、Br NAC087和Br NAC092有转录激活活性。3.通过EMSA、Ch IP-q PCR和烟草瞬时表达体系等明确了Br NAC041、Br NAC055、Br NAC087和Br NAC092的靶基因及其转录调控效应。发现Br NAC055可通过直接激活Br NYE1、Br NYC1、Br Rboh B和Br Rboh C等叶绿素降解和ROS合成基因的转录来调控采后菜心叶片衰老。Br NAC055在烟草叶片中瞬时表达也诱导了ROS积累和叶绿素降解,加速了叶片衰老。制备了Br NAC041、Br NAC087和Br NAC092多克隆抗体,蛋白质印迹（western blot）实验结果显示与它们的基因表达相似,随着叶片衰老,Br NAC041、Br NAC087和Br NAC092的蛋白表达水平增加,外源ABA处理也增强了它们的蛋白表达。进一步实验表明Br NAC087和Br NAC092均能直接靶定衰老相关基因（Br SAG12）、叶绿素降解基因（Br NYE1、Br NYC1、Br NOL1、Br PPH1、Br PAO和Br RCCR）、ABA合成（Br NCED3和Br ABA2）及GA降解基因（Br GA2ox1）启动子上的NAC结合元件NACRS,并激活这些基因的启动子活性,而Br NAC041直接抑制GA合成相关基因（Br KAO2和Br GA20ox2）和ABA降解相关基因（Br CYP707A3）的转录。这些结果说明Br NAC041、Br NAC087和Br NAC092通过直接调控叶绿素降解、ROS合成、内源ABA和GA合成及代谢,参与ABA诱导的采后菜心叶片衰老。4.通过烟草叶片瞬时表达和拟南芥转基因验证了Br NAC092的生物学功能。Br NAC092在烟草叶片中瞬时表达诱导了ROS积累和叶绿素降解,上调了ROS合成、叶绿素降解、ABA合成和GA降解等相关基因的表达,促进叶片衰老。用外源ABA分别处理野生型、ananc092突变体和超表达Br NAC092的拟南芥植株叶片,实验所得结果也进一步说明Br NAC092通过影响叶绿素降解、ROS合成、ABA和GA合成及代谢,调控ABA诱导的叶片衰老。