目前,冠心病仍是威胁人类生命健康的主要疾病,急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是其中一种重要的临床类型,具有高致残率、高死亡率的临床特点。迅速开通梗死相关动脉(infarction related artery,IRA),恢复心肌的有效再灌注是治疗AMI的基本原则。如今,溶栓治疗或直接经皮冠状动脉介入治疗(primary percutaneous coronary intervention,PCI)已成为ST段抬高心肌梗死(ST segment elevation myocardial infarction,STEMI)患者的重要治疗策略。然而,缺血心肌在恢复血液灌注后,引起超微结构、功能、代谢及电生理方面发生进一步损伤,这种在缺血损伤的基础上再次引起的损伤称为心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤。虽然介入治疗技术和治疗药物已取得了快速发展,但仍无确切有效的方法预防和治疗心肌的I/R损伤,因此在恢复心肌有效再灌注的同时避免和减轻I/R损伤仍是当今研究的热点。山莨菪碱(anisodamine,Ani)是从茄科植物唐古特山莨菪中提取的一种颠茄生物碱。Ani在传统药理学分类中为毒蕈碱型(M)胆碱受体拮抗剂,但其周围神经系统毒性低于阿托品,中枢神经系统毒性低于东莨菪碱,且对心肌及冠脉微循环有着多种药理学上的有益作用,在提高心率的同时可升高冠脉内平均灌注压,改善冠脉前向血流,增加心肌组织灌注,安全性高,价格低廉。近几十年的研究证明,Ani还具有多种非胆碱受体拮抗剂的药理作用,包括调节微血管张力,增加细胞膜脂质流动性和血细胞的变形能力,抑制血小板聚集及抗血栓形成,抗氧化和清除过氧化物,抑制细胞凋亡和胞内钙超载等,均与Ani的心血管保护效应有关。而且我中心既往临床研究发现,冠脉内注射500μg、1000μg、1500μg或3000μg Ani均可改善STEMI直接PCI患者的心肌再灌注水平,预防和改善无复流现象。然而,冠脉内应用不同剂量的Ani是否具有不同的心肌保护效应以及是否存在量效关系尚不确定。进一步研究表明,Ani还可减轻心脏骤停复苏模型大鼠心肌线粒体结构和功能的损伤程度,但具体机制尚未阐明。本研究以前期临床和基础研究为基础,观察冠脉内预防性应用不同剂量的Ani对I/R损伤心肌的保护作用及可能存在的量效关系,并进一步探讨线粒体ATP敏感性钾通道(mitochondrial ATP-sensitive K+channel,mito KATP)介导的线粒体保护机制。本研究共分为三部分:第一部分,对STEMI直接PCI患者冠脉开通前预防性冠脉内注射不同剂量的Ani,观察和比较不同剂量Ani对心肌再灌注指标和心功能参数的影响,并分析是否存在量效关系。第二部分,从大鼠离体心脏水平出发,排除神经体液因素的干扰,观察Ani对I/R损伤心肌的保护作用是否与mito KATP有关。第三部分,应用乳鼠心肌细胞探讨mito KATP介导Ani抗心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤的具体机制。第一部分冠脉内预防性应用不同剂量山莨菪碱对ST段抬高心肌梗死直接PCI术后心肌再灌注的保护效应目的:探讨冠脉内预防性应用不同剂量的Ani对STEMI患者直接PCI术后心肌再灌注水平的保护效应以及可能存在的量效关系。方法:入选2014年1月至2015年6月河北医科大学第二医院心血管内科收住的行直接PCI的STEMI患者。将符合入选标准的患者随机分为A(对照组)、B(1000μg Ani)、C(2000μg Ani)、D(4000μg Ani)四组。当导引导丝通过IRA病变或球囊扩张后(支架植入前),且心肌梗死溶栓试验(TIMI)血流>0级,立即经指引导管给予冠脉内注射相应药物。A组患者冠脉内注射生理盐水4 ml;B、C、D组患者冠脉内分别注射1000μg、2000μg和4000μg Ani,且分别预先溶于4 ml等量的生理盐水中。对所有患者经前臂(桡/尺)动脉入经行冠状动脉造影检查及直接PCI治疗。由两名或以上对患者病情及研究方案均不知情的介入心脏病医生对冠脉造影及介入治疗参数进行判定与分析,包括初始及支架植入后的TIMI血流分级、TIMI心肌灌注分级(TMPG)、校正的TIMI帧数计数(c TFC)、TMPG及c TFC的变化幅度等指标。评估血栓负荷积分,并根据患者临床和造影特点决定是否冠脉内给予替罗非班。经指引导管进行有创血流动力学监测,记录给药前、给药后5分钟及10分钟时的心率、冠脉收缩压(SBP)、舒张压(DBP)及平均动脉压(MBP),观察再灌注性心律失常的发生情况。记录患者急诊入院及术后90 min时的心电图(ECG),计算完全ST段回落(STR)比例。急诊入院后即刻及PCI术后每隔6 h测定心肌损伤标志物肌酸激酶同工酶(CK-MB)和心肌肌钙蛋白I(c Tn I)的水平,记录二者的峰值。测定患者入院后基线及PCI术后24 h和72 h的高敏C反应蛋白(hs-CRP)水平。患者入院时、直接PCI术后1周及3个月随访时行超声心动图检查,评估左室射血分数(LVEF)。研究的主要终点为直接PCI术后TMPG和c TFC的联合终点。次要终点为患者住院期间及3个月随访时的主要不良心血管事件(MACEs)。结果:本研究最终纳入140例患者,其中A组36例,B组35例,C组35例,D组34例。四组患者的基线资料、发病至球囊扩张和入院至球囊扩张的平均时间以及冠状动脉造影参数等均无统计学差异。而C和D组患者的完全STR比例明显高于A组(P=0.032 and P=0.019,respectively)。随着Ani剂量的增加,B、C、D三组完全STR比例也随之增加(71.43%,77.14%and 79.41%),但三组间比较尚未达到统计学差异(all P>0.05)。四组患者的初始TIMI血流3级比例和初始c TFC帧数均无统计学差异。与A组相比,B、C、D三组患者术后TIMI血流3级的比例均有增加的趋势,但差异无统计学意义(P=0.062)。B、C和D组术后TMPG 3级的比例和TMPG增加幅度均较A组明显增加(all P<0.05)。B、C和D组的术后c TFC帧数均较A组明显减少(all P<0.01),且B、C、D各组的c TFC帧数下降幅度均明显高于A组(B vs.A:P<0.05;C vs.A:P<0.05;D vs.A:P<0.01)。随着Ani剂量的增加,B、C、D各组术后c TFC帧数随之减少(22.7±6.17,21.82±6.88 and 21.30±5.49),术后c TFC下降幅度随之增加(12.58±8.61,13.14±8.19 and 14.19±7.83),但三组间比较尚未达到统计学差异。四组患者注射药物之前的冠脉SBP、DBP、MBP及心率(即基线值)均没有统计学差异。用药后5min时,B组的SBP、DBP、和MBP较基线值有升高趋势,但差异尚未达到统计学意义,而B组的心率及C、D组的SBP、DBP、MBP和心率均较基线值明显增高(all P<0.01),且D组的SBP及B、C、D三组的DBP、MBP和心率均明显高于A组(all P<0.05)。随着Ani剂量的增加,用药5min时B、C、D三组SBP、DBP、MBP和心率的水平也随之增加,除了D组的心率明显快于B、C组(both P<0.001)之外,三组之间其他指标差异尚未达到统计学意义。用药后10min时,B、C、D三组的SBP、DBP、MBP均逐渐下降至接近基线水平,C、D组的心率下降缓慢仍明显快于基线值,且D组心率仍快于A、C组(P<0.001and P<0.01,respectively)。关于PCI术中出现的不良反应,显示A组和B组分别有4例(11.11%)和1例(2.86%)患者发生了低血压,C组和D组均未出现且与A组相比具有统计学差异(both P<0.05)。A组有3例(8.33%)患者发生了症状性心动过缓,B、C和D组均未出现(B or C or D vs.A:all P<0.05)。A组和B组分别有5例(13.89%)和2例(5.71%)患者发生了快速性再灌注性心律失常,C组和D组均未出现(C or D vs.A:both P<0.05)。冠脉内注射三种剂量的Ani后10分钟时均未出现严重的窦性心动过速(定义为心率超过130次/min,或心率增加40次/min以上)。与A组相比,B、C和D组的CK-MB和c Tn I峰值明显降低(CK-MB:B or C vs.A:both P<0.05;D vs.A:P<0.01;c Tn I:all P<0.05)。四组患者入院时的基线hs-CRP水平无统计学差异,而B、C和D组患者PCI术后24h和72h的hs-CRP水平均较A组明显下降(24h:B vs.A P<0.01,C or D vs.A:P<0.001;72h:all P<0.05)。随着Ani剂量的增加,B、C、D三组的CK-MB和c Tn I峰值以及术后24h和72h的hs-CRP水平随之下降,但三组间比较均尚未达到统计学差异。PCI术后1周时,C和D组患者的LVEF明显高于A组(both P<0.05),且出院后3个月随访时,B、C和D三组患者的LVEF均较A组明显增加(both P<0.05)。随着Ani剂量的增加,B、C、D三组术后1周和3个月随访时的LVEF随之增加,但三组间比较均尚未达到统计学差异。住院期间及3个月随访时,D组患者的总MACEs发生率明显低于A组(P=0.025and P=0.012,respectively),且随着Ani剂量的增加,B、C、D三组住院期间及3个月随访时的总MACEs发生率随之下降,但三组间比较也尚未达到统计学差异。Kaplan-Meier生存曲线分析显示,B、C和D组患者的无MACEs生存率均高于A组(P=0.019)。结论:STEMI患者直接PCI术中冠脉内预防性应用三种剂量(1000μg、2000μg、4000μg)的Ani均可不同程度地改善心肌再灌注水平,减少心肌损伤和心肌梗死面积以及炎症反应,同时保护左心室功能,改善患者预后,并表现出剂量依赖性趋势,且未见明显不良反应。第二部分山莨菪碱对离体大鼠心脏缺血/再灌注损伤心肌的保护作用及其线粒体保护机制目的:观察离体大鼠心脏再灌注早期给予Ani对I/R损伤心肌的保护效应,并初步探讨线粒体KATP敏感性钾通道(mito KATP)是否参与了该保护作用。方法:采用Langendorff离体心脏灌流装置灌流大鼠离体心脏,并建立离体心脏I/R损伤模型。第一步,将健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠的离体心脏随机分为6个药物浓度组:Control、I/R、I/R+Ani 0.03m M、I/R+Ani 0.10m M、I/R+Ani 0.30m M与I/R+Ani 1.00m M组,以确定Ani的最佳保护用药浓度。药物的灌流时间初步采用30min。通过BIOPAC 16道生理信号采集分析系统监测各组血流动力学指标,包括心率(HR)、左心室收缩压(LVSP)峰值、左心室舒张末压(LVEDP)、左心室发展压(LVDP=LVSP-LVEDP)、左心室压力最大上升速率(dp/dtmax)与最大下降速率(-dp/dtmax)以及冠脉流量(CF)。2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色法测定心肌梗死面积,酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒检测冠脉流出液中心肌肌钙蛋白I(c Tn I)水平。第二步,用此最佳保护用药浓度的Ani台式液分别灌流不同的时间,即分为6个时间组:Control、I/R、I/R+Ani 15min、I/R+Ani 30min、I/R+Ani 45min与I/R+Ani 60min组。检测冠脉流出液中c Tn I水平,以确定最佳保护用药时间。第三步,观察mito KATP阻断剂5-羟基癸酸(5-HD)对Ani保护I/R损伤离体心脏的影响,将离体心脏随机分配至5个实验组:Control、I/R、I/R+Ani、I/R+Ani+5-HD与I/R+5-HD组。监测各组血流动力学指标,观察各种室性再灌注性心律失常出现的次数及持续时间并进行再灌注性心律失常评分,测定心肌梗死面积和冠脉流出液中c Tn I水平,比色法测定心肌组织中ATP和丙二醛(MDA)的含量以及超氧化物歧化酶(SOD)的活性,透射电镜观察心肌及线粒体的超微结构改变。结果:第一步的6个实验组最终共使用30个离体心脏,每组5个。该6组的离体心脏在稳定期的各项血流动力学指标均没有统计学差异。与Control组相比,I/R组各项心功能指标均有明显下降(all P<0.05)。当Ani的浓度为0.30m M时,各项指标改善效果最明显,表现在再灌注后15、30、45、60min的LVDP、dp/dtmax、-dp/dtmax及CF较I/R组均明显升高(all P<0.05),而Ani对HR的影响无统计学意义。与I/R组相比,I/R+0.30m M Ani组心肌梗死面积的减少程度最明显(P<0.001),且c Tn I释放水平受到的抑制效果最强(P<0.001)。故Ani的最佳保护用药浓度为0.30m M,后续实验采用此浓度。第二步的6个实验组最终共使用24个离体心脏,每组4个。用含0.30m M Ani的台式液灌流心脏30min,与I/R组相比,c Tn I含量降低程度最明显(P<0.001)。故Ani的最佳保护用药时间为30min,后续实验采用该时间。第三步的5个实验组最终使用40个离体心脏,每组8个。该5组离体心脏的各项血流动力学指标基线值均没有统计学差异。与I/R组相比,I/R+Ani组的各项血流动力学指标明显改善,即提高了LVDP、dp/dtmax、-dp/dtmax及CF(all P<0.05),对HR无明显影响。I/R+Ani+5-HD组在再灌注的各时间点上除HR以外的各项指标均明显下降(all P<0.05)。与I/R组相比,单独灌流5-HD对再灌注后的血流动力学指标无明显影响。I/R+Ani组的心肌梗死面积和c Tn I释放量均较I/R组明显减少(P<0.001and P<0.01,respectively),而I/R+Ani+5-HD组二者数值均较I/R+Ani组明显升高(P<0.001 and P<0.01,respectively)。与I/R组相比,仅灌流5-HD对心肌梗死面积和c Tn I释放量无明显影响。与I/R组相比,I/R+Ani组各种再灌注性心律失常包括室性期前收缩(PVC)、室性心动过速(VT)和心室颤动(VF)的发生次数以及VT和VF的持续时间显著减少(P<0.05)。与I/R+Ani组相比,I/R+Ani+5-HD组的PVC和VT发生次数及VT持续时间有所增加(P<0.05)。I/R+Ani组的再灌注性心律失常评分较I/R组有一定程度的降低,同时应用Ani和5-HD部分拮抗了Ani的这种改善作用。单独灌流5-HD对再灌注性心律失常的发生没有影响。I/R组的ATP含量和SOD活性明显低于Control组,而MDA水平明显升高(all P<0.001)。I/R+Ani组的ATP含量和SOD活性较I/R组明显升高,MDA水平显著降低(P<0.01,P<0.001 and P<0.01,respectively)。同时灌流Ani和5-HD在一定程度上削减了Ani的保护作用,使ATP含量和SOD活性降低(both P<0.05),MDA的水平增加(P<0.001)。用透射电镜观察心肌组织的超微结构,显示I/R组的心肌及线粒体结构损伤明显,肌节消失,肌原纤维断裂、溶解消失,核质高度肿胀,大部分线粒体嵴断裂溶解、线粒体膜破裂。I/R+Ani组较I/R组损伤明显减轻,肌原纤维排列较整齐,核质无明显肿胀,线粒体嵴膜无溶解。而I/R+Ani+5-HD组的损伤程度重于I/R+Ani组,肌原纤维间有肿胀,核质轻度肿胀,线粒体嵴膜部分融合。I/R+5-HD组与I/R组的损伤程度相似。结论:1应用Ani可明显改善I/R损伤离体大鼠心脏的血流动力学指标,减少室性再灌注性心律失常的发生。2 Ani可明显改善I/R损伤心肌的能量代谢,减少心肌梗死面积和氧化应激反应,减轻心肌及线粒体超微结构损伤。3 mito KATP阻断剂5-HD可在一定程度上抑制Ani的以上保护效应,表明山莨菪碱减轻心肌I/R损伤可能与mito KATP的开放有关。第三部分山莨菪碱通过线粒体ATP敏感性钾通道对乳鼠缺氧/复氧损伤心肌细胞的保护作用及其机制探讨目的:观察复氧早期给予山莨菪碱对乳鼠心肌细胞H/R损伤及线粒体功能的保护作用,并探讨mito KATP参与的具体机制。方法:使用出生1~3天的健康SD大鼠乳鼠,进行乳鼠心肌细胞的分离和原代培养。分离的乳鼠心肌细胞正常培养72h后交织成网状,出现同步性搏动。采用横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)免疫细胞化学法对分离的乳鼠心肌细胞进行纯度鉴定,纯度达99%以上。通过无血清无糖缺氧培养3h,之后完全培养基正常培养12h,建立心肌细胞H/R模型。第一步,将生长至72h的乳鼠心肌细胞随机分配至7个药物浓度组:Control、H/R、H/R+Ani 10-8m M、H/R+Ani 10-7m M、H/R+Ani 10-6m M、H/R+Ani10-5m M和H/R+Ani 10-4m M组。噻唑蓝(MTT)染色测定心肌细胞的活性,以确定Ani的最佳保护用药浓度。第二步,观察mito KATP阻断剂5-HD对Ani保护乳鼠心肌细胞H/R损伤的影响。将心肌细胞随机分配至5个实验组:Control、H/R、H/R+Ani、H/R+Ani+5-HD及H/R+5-HD组。各实验组处理结束后,MTT法检测细胞活性,ELISA试剂盒检测细胞培养液中c Tn I释放量,比色法检测细胞中ATP和MDA的含量以及SOD和线粒体呼吸链复合物V的活性,并用BCA(bicinchonininc acid,二辛可宁酸)法分别测定心肌细胞总蛋白及线粒体蛋白浓度。应用钙离子荧光探针Fluo-3/AM孵育心肌细胞,用荧光显微镜观察荧光强度的变化以测定胞浆内钙离子浓度,同理,用钙离子荧光探针Rhod-2/AM测定线粒体内钙离子浓度,荧光探针JC-1检测线粒体膜电位的变化。结果:通过MTT法检测7个药物浓度组各组的OD值,结果显示,H/R组的细胞活性较Control组明显下降(P<0.001);与H/R组和其他Ani浓度组相比,当Ani的浓度为10-6m M时,心肌细胞的OD值最大,即细胞活性最好,故10-6m M为Ani的最佳保护用药浓度,后续实验采用此浓度。应用5-HD后,MTT检测结果显示,与H/R+Ani组相比,H/R+Ani+5-HD组的心肌细胞活性显著降低(P<0.01),而单独应用5-HD对H/R心肌细胞的活性没有影响。H/R组的c Tn I释放水平显著高于Control组(P<0.01),而H/R+Ani组的c Tn I水平较H/R组明显降低(P<0.01)。与H/R+Ani组相比,同时加入Ani和5-HD可抑制c Tn I水平的降低(P<0.05)。单独应用5-HD对H/R损伤后c Tn I的释放水平无影响。H/R组的心肌细胞内ATP含量较Control组显著减少(P<0.001),与H/R组相比,H/R+Ani组的ATP含量显著增加(P<0.001),而H/R+Ani+5-HD组ATP含量明显低于H/R+Ani组(P<0.01)。H/R+5-HD组的ATP含量与H/R+Ani组相比无统计学差异。与Control组相比,H/R组心肌细胞内的线粒体呼吸链复合物V活性明显降低(P<0.001)。H/R+Ani组该复合物的活性明显高于H/R组(P<0.05),而在应用Ani的同时加入5-HD可使其活性明显降低(P<0.05),单独应用5-HD对该复合物的活性无影响。H/R组心肌细胞内的MDA含量明显高于Control组(P<0.001)。H/R+Ani组的MDA含量较H/R组明显减少(P<0.01),而H/R+Ani+5-HD组的MDA含量显著高于H/R+Ani组(P<0.05)。单独应用5-HD对心肌细胞内MDA的含量无影响。H/R组心肌细胞SOD的活性较Control组明显下降(P<0.001),H/R+Ani组的SOD活性较H/R组明显增加(P<0.001),而H/R+Ani+5-HD组的SOD活性明显低于H/R+Ani组(P<0.001)。单独应用5-HD对心肌细胞内SOD的活性无影响。用荧光显微镜观察到H/R组Fluo-3/AM标记的绿色荧光强度明显强于Control组(P<0.001)。与H/R组相比,H/R+Ani组的荧光强度明显减弱(P<0.01)。而在给予心肌细胞Ani的同时加入5-HD,可使细胞内的相对荧光强度值明显高于H/R+Ani组(P<0.05)。对心肌细胞单独给予5-HD处理不影响胞内钙离子的浓度。H/R组Rhod-2/AM标记的红色荧光强度明显强于Control组(P<0.001),H/R+Ani组的荧光强度较H/R组明显减弱(P<0.05),而H/R+Ani+5-HD组的荧光强度明显高于H/R+Ani组(P<0.05)。对心肌细胞单独给予5-HD处理并不影响线粒体内钙浓度。应用荧光探针JC-1标记心肌细胞,JC-1聚合物和JC-1单体的荧光强度分别对应高、低水平的线粒体膜电位。与Control组相比,H/R组JC-1聚合物的相对荧光强度值显著降低(P<0.001),而JC-1单体的相对荧光强度值明显增加(P<0.01)。H/R+Ani组JC-1聚合物的相对荧光强度值较H/R组明显增加(P<0.01),而JC-1单体的相对荧光强度值较H/R组明显减少(P<0.01)。H/R+Ani+5-HD组JC-1聚合物的相对荧光强度值低于H/R+Ani组(P<0.05),而JC-1单体的相对荧光强度值高于H/R+Ani组(P<0.05)。单独给予心肌细胞5-HD处理对H/R损伤后的心肌细胞线粒体膜电位变化没有影响。结论:1乳鼠心肌细胞复氧早期给予Ani干预可明显增强细胞活性,减轻心肌细胞损伤和氧化应激程度,改善细胞能量代谢和线粒体的功能。2 mito KATP阻断剂5-HD可部分抑制Ani的以上保护效应,表明Ani可能通过开放mito KATP发挥抗心肌细胞H/R损伤的作用。