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研究背景:血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是由两条相同多肽链通过二硫键构成的同源二聚体糖蛋白。VEGF可以由上皮细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞等多种细胞产生。VEGF是内皮细胞的有丝分裂原,可以促进内皮细胞的存活和迁移。VEGF是肿瘤生长中最重要的血管生成因子,可以作为潜在的肿瘤治疗靶点。VEGF组成性及诱导性的表达是一个复杂的事件,涉及多条胞内信号通路及多种转录因子,目前VEGF表达确切的机制仍然不清。micro RNAs(miRNAs)是一群非编码RNA,长度为23bp左右,其主要通过抑制靶基因的翻译或者直接引起m RNA降解来调控其表达。miRNAs在细胞代谢、增生、分化、凋亡等多种生物学过程中均有重要作用。近来有报道表明,miRNAs可以参与血管的生成和VEGF表达的调控。miR-20b是miR-106a-363基因簇家族成员之一,与来自于miR-17-92基因簇的miR-20a和来自于miR-106b-25基因簇的miR-93具有高度同源性。最近,miR-20a和miR-93相继被报道可以调控VEGF的产生,但是目前关于miR-20b调控VEGF产生的研究报道较少。目的:探讨miR-20b对H22细胞VEGF产生的影响及其相关机制。方法:TGF-β1刺激小鼠肝癌细胞株H22细胞后,荧光定量PCR检测miR-20b、VEGF基因表达情况,免疫印迹检测VEGF蛋白表达情况。H22细胞转染miR-20b模拟物(mimics)或其阴性对照(scramble)24h后,在有或无TGF-β1刺激的情况下,荧光定量PCR及免疫印迹检VGEF基因和蛋白的表达,同时对参与VEGF表达的转录因子STAT3的表达情况进行了检测。miRanda算法预测STAT3 3’-UTR区是否存在miR-20b的结合位点;构建含有STAT3 3’-UTR的双荧光素酶报告基因重组质粒载体,然后使用重组质粒与miR-20b mimics/scramble共转染Hela细胞,通过双荧光素酶活性检测试剂盒检测报告基因海肾荧光素酶的活性;H22细胞使用si RNA干扰STAT3基因表达后,荧光定量PCR检测VEGF基因表达情况,免疫印迹检测VEGF的蛋白表达情况;miR-20b mimics转染H22细胞,然后使用STAT3 si RNA干扰,免疫印迹检测VEGF的蛋白表达情况。结果:TGF-β1刺激H22细胞6h、12h、24h,miR-20b相对表达下调(P<0.05),TGF-β1刺激H22细胞6h、12h VEGF m RNA的相对表达量上调(P<0.05),刺激H22细胞12h、24h,VEGF蛋白相对表达量上调(P<0.05)。相对于TGF-β1单刺激组,转染miR-20b mimics的TGF-β1刺激组VEGF基因和蛋白相对表达量均显著下调(P<0.01)。H22细胞转染miR-20b mimics或miR-20b scramble 24h后,与空白对照(control)组相比,miR-20b mimics组VEGF m RNA的相对表达无明显变化,但VEGF蛋白水平相对表达明显下调(P<0.05)。利用miRanda算法可以预测到STAT3 3’-UTR区存在miR-20b的结合位点(GCACUUU序列);H22细胞转染miR-20b mimics后STAT3蛋白水平相对表达下调(P<0.05)。电泳法和测序法证明成功构建pmiR-RB-ReportTM-STAT3 3’-UTR双荧光素酶报告载体;重组质粒+miR-20b mimics共转染组荧光素酶活性明显低于空质粒+miR-20b mimics及空质粒+miR-20b scramble共转染组(P<0.05)。H22细胞STAT3基因干扰后,VEGF的m RNA和蛋白相对表达量明显下调(P<0.05)。H22细胞转染miR-20b mimics或miR-20b scramble,STAT3基因干扰24h后,相对于control组,si-STAT3+miR-20b mimics组、si-STAT3对照物(si-NC)+miR-20b mimics组的VEGF蛋白相对表达均有下调,而miR-20b mimics+si-NC组与miR-20b mimics+si-STAT3相比,VEGF蛋白相对表达下降的更为明显(P<0.05)。结论:TGF-β1诱导H22细胞中VEGF表达上调,miR-20b表达下调;miR-20b负向调控H22细胞VEGF的表达;miR-20b直接靶向STAT3 3’-UTR而负性调节其表达;STAT3正向调控H22细胞VEGF的表达;STAT3参与miR-20b负向调控H22细胞VEGF表达的过程。