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香菇多糖系从香菇子实体中提取纯化而得到的高分子葡聚糖,是一种宿主免疫增强剂,具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节和刺激干扰素形成等功能。目前研究较多的为碱提高分子量香菇多糖,水提香菇多糖的研究较为少见。本课题以香菇子实体为原料,采用水提醇沉、过氧化氢脱色和超滤法分级分离得到三种均一分子量水溶性精制香菇多糖组分,分别命名为 LTP1、LTP2和LTP3,并在此基础上进一步研究其化学结构、糖链构象及体内外抗肿瘤活性。 文章从以下三部分就水溶性香菇多糖的分离纯化、结构分析及体内外抗肿瘤活性研究进行了综述。 第一部分水溶性香菇多糖的提取、分离和纯化 以房县小花菇为原料,采用热水提取、乙醇沉淀法从香菇子实体中提取香菇粗多糖,经过过氧化氢脱色和超滤法分级分离得到三种水溶性精制香菇多糖组分;通过对各组分进行糖含量测定、相对分子质量检测、碘-碘化钾试验及紫外扫描鉴定其纯度;通过元素分析、比旋光度测定和糖类物质定性鉴别试验分析其理化性质。经分离纯化得到三种精制香菇多糖组分LTP1、LTP2和LTP3,苯酚-硫酸法测得糖含量分别为98.86％、100.73％和99.03％,高效凝胶色谱法测得相对分子质量分别为6.621×105 Da、3.062×105 Da和9.055×104 Da,碘-碘化钾试验及紫外扫描图谱显示各组分均不含淀粉、蛋白质和核酸;元素分析显示C:H:O≈1:2:1,比旋光度([α]20D)分别为+46.278、-6.330、-5.500,定性鉴别试验说明三者均为糖类物质,且不含还原糖。因此,本课题制得的水溶性精制香菇多糖LTP1、LTP2和LTP3为分子量均一、高纯度的多糖组分。 第二部分水溶性香菇多糖的结构分析 采用完全酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化分析等化学方法和气相色谱-质谱联用技术、傅立叶红外光谱法及核磁共振波谱技术等波谱学方法综合分析LTP1、LTP2和LTP3的一级结构,采用刚果红实验对其糖链构象进行初步研究。完全酸水解结果显示三者均由D-葡萄糖组成;综合分析高碘酸氧化、Smith降解和甲基化结果可知,LTP1、LTP2和LTP3的糖残基连接类型均包括末端、(1-3)、(1-4)、(1-6)和(1-3-6)连接,其中,(1-4)连接类型含量很少,末端、(1-3)、(1-6)和(1-3-6)连接的摩尔比分别近似于1:2:1:2、1:2:2:2、1:1:5:1;核磁共振波谱显示LTP1、LTP2和LTP3的水解产物LTP1-p、LTP2-p和LTP3-p可能分别含有六种、七种、八种类型的糖残基;红外光谱显示 LTP1、LTP2和LTP3均为多糖类物质,LTP1含有α和β两种构型的糖苷键,以α构型为主,而LTP2和LTP3均只含有β构型的糖苷键,三者均为D-吡喃葡萄糖环结构;刚果红实验结果表明LTP1具有三股螺旋构象,LTP2和LTP3的空间构象有待于进一步研究。 第三部分水溶性香菇多糖的体内外抗肿瘤活性研究 以体外培养法分别探讨LTP1、LTP2和LTP3对小鼠肝癌细胞H22、小鼠肉瘤细胞S180、人乳腺癌细胞MCF-7及人白血病细胞K562增殖的抑制作用,采用MTT比色法检测其抑制率;以 S180荷瘤小鼠为模型进行体内抗肿瘤实验,探讨精制香菇多糖LTP1的体内抑瘤作用及其对免疫器官的影响。结果显示LTP1和LTP2对H22、S180、MCF-7和K562细胞体外增殖均具有抑制作用,但对K562的抑制作用较弱,LTP3仅对H22和S180细胞体外增殖有抑制作用,三个组分的体外抗肿瘤活性总体呈剂量依赖性,且LTP1的活性明显高于LTP2和LTP3;LTP1对S180荷瘤小鼠的瘤体具有明显的抑制作用,抑瘤率达54.97％,且呈剂量依赖性,同时还可能刺激荷瘤小鼠脾细胞的成熟、分化和增殖,提高免疫功能。