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免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia, ITP)是临床上最常见的出血性疾病,约占出血性疾病总数的30%。临床表现主要为皮肤粘膜出血,以及胃肠道、泌尿生殖道出血甚至颅内出血,严重者可能危及生命。目前公认本病是一种获得性自身免疫性疾病,血小板自身抗体和/或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)所介导的血小板破坏增多和巨核细胞成熟障碍引起的血小板生成减少都在本病的发病机制中具有重要作用。妊娠期合并血小板减少是常见的妊娠期合并症,其发病率约10%,可由多种疾病引起,以妊娠期血小板减少症(gestational thrombocytopenia, GT)最常见;妊娠合并ITP亦是比较常见的原因,约占妊娠合并血小板减少的5%。妊娠期血小板减少症是一种妊娠期的良性疾病,对孕妇和胎儿均无不良影响,临床上一般无需进行治疗;而妊娠合并ITP则可能严重影响母体和胎儿健康,使妊娠及其处理复杂化。母体的IgG型抗血小板抗体可通过胎盘到达胎儿循环,导致胎儿血小板减少及出血,表现为胎儿或新生儿的消化道及颅内出血。因此,尽早鉴别和诊断妊娠合并ITP,并准确评估孕妇和新生儿的出血风险及预后情况,对于疾病的及时治疗和密切监护具有重要意义。血小板生成素(thrombopoietin, TPO)能够与c-Mpl受体特异性结合,进而发挥生物学效应,调节巨核细胞增殖、分化、成熟,并分裂形成有功能的血小板。TPO主要在肝脏内产生,进入血液循环后,与血小板和巨核细胞表面的c-Mpl受体结合而被清除。由于功能正常的肝脏产生TPO的速度基本恒定,因此外周血TPO浓度主要被血小板计数调控,血小板计数越低,TPO水平越高。然而,近年来有多项研究发现,ITP患者血清TPO水平略高于甚至不高于健康对照组;由于ITP患者血小板计数显著降低,有学者认为内源性TPO生成不足为ITP发病机制之一。为了研究妊娠合并ITP患者与妊娠期血小板减少症患者TPO水平是否存在差异,进而讨论TPO水平可否作为鉴别诊断妊娠合并ITP与GT的参考指标,并进一步探讨妊娠合并ITP的发病机制,我们研究了妊娠合并ITP患者、妊娠期血小板减少症患者、正常妊娠女性、非妊娠期育龄女性ITP患者以及正常育龄女性的外周血血清TPO水平,以及妊娠合并ITP患者和非妊娠期育龄女性ITP患者的骨髓细胞学涂片。我们发现,妊娠合并ITP患者的血清TPO水平显著高于GT患者,在35位妊娠合并ITP患者中,29位患者的TPO水平高于500 pg/mL,而全部31位GT患者的血清TPO水平均低于500 pg/mL。因此,我们推测,血清TPO水平可以作为鉴别诊断妊娠合并ITP与GT的参考指标,TPO水平高于500 pg/mL的妊娠女性患者极有可能为妊娠合并ITP患者,需要密切监护和积极治疗。另一方面,我们还发现妊娠合并ITP患者的血清TPO水平显著高于非妊娠期育龄女性ITP患者。近年来多项研究证实,巨核细胞不足所引起的血小板减少症患者TPO水平显著升高,而血小板破坏增多所引起的血小板减少症患者TPO水平较低。因此,我们进一步对比了妊娠合并ITP患者和非妊娠期育龄女性ITP患者的骨髓细胞学涂片,对比结果显示,非妊娠期育龄女性ITP患者骨髓中巨核细胞数目正常或增多,而半数以上的妊娠合并ITP患者骨髓中巨核细胞数目减少。以上结果提示,妊娠合并ITP的发病可能与骨髓中巨核细胞产生血小板减少有关,其发病机制可能与非妊娠期ITP不同。第一部分:妊娠合并ITP患者血清TPO水平及其鉴别诊断价值的研究目的:检测妊娠合并ITP患者、妊娠期血小板减少症患者及非妊娠期育龄女性ITP患者的外周血血清TPO水平,通过比较妊娠合并ITP患者与GT患者及与非妊娠ITP患者TPO水平的差异,分析TPO作为妊娠合并ITP与GT鉴别诊断参考指标的可行性,并进一步探讨妊娠合并ITP的发病机制。方法:1.收集35例妊娠合并ITP患者、31例GT患者、32例正常妊娠女性、32例非妊娠期育龄女性ITP患者及35例正常育龄女性的外周血,检测外周血血小板计数,并分离血清备用。2.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中TPO的浓度。3.对23例妊娠合并ITP患者和27例非妊娠期育龄女性ITP患者行髂后上嵴骨髓穿刺,并进行骨髓细胞学涂片,Wright-Giemsa染色,计数巨核细胞。4.改良单克隆抗体俘获血小板抗原技术(MAIPA)检测25例妊娠合并ITP患者及32例非妊娠期育龄女性ITP患者血浆中血小板自体抗体。结果:1.妊娠合并ITP患者血清TPO水平显著高于GT患者。妊娠合并ITP组血清TPO水平显著高于GT组(均数±标准差,1283±646 pg/mL vs.187±64 pg/mL,P<0.01);在35位妊娠合并ITP患者中,29位患者的TPO水平高于500 pg/mL,而全部31位GT患者的血清TPO水平均低于500 pg/mL。这些结果说明,血清TPO水平可以作为鉴别诊断妊娠合并ITP与GT的参考指标,TPO水平高于500 pg/mL的妊娠女性患者更有可能为妊娠合并ITP患者。2.妊娠合并ITP患者血清TPO水平显著高于非妊娠期育龄女性ITP患者。妊娠合并ITP组血清TPO水平显著高于非妊娠期育龄女性ITP组(均数±标准差,1283±646 pg/mL vs.88±41 pg/mL,P<0.01).3.大多数妊娠合并ITP患者骨髓巨核细胞数量减少。将骨髓细胞学涂片中每1到3个低倍视野见1个巨核细胞定义为巨核细胞数量正常,每个低倍视野>2个巨核细胞为巨核细胞数量增多,每5到10个低倍视野见1个巨核细胞为巨核细胞数量减少。基于上述标准,在23例妊娠合并ITP患者中,14例(60.9%)巨核细胞数量减少,5例(21.7%)正常,4例(17.4%)增多;而在27例非妊娠期育龄女性ITP患者中,10例(37.0%)巨核细胞数量正常,17例(63.0%)增多。以上结果说明,大多数妊娠合并ITP患者骨髓巨核细胞数量减少,而大多数非妊娠期育龄女性ITP患者骨髓巨核细胞数量增多,妊娠与非妊娠ITP发病机制可能存在差异。4.妊娠合并ITP患者与非妊娠期育龄女性ITP患者血小板抗体无显著差异。改良MAIPA法检测血小板抗体,将吸光度大于正常对照组均数+3倍标准差定义为抗血小板抗体阳性。25例妊娠合并ITP患者和32例非妊娠期育龄女性ITP患者中,血小板抗体阳性率分别为44.0%和62.5%,差异不具有显著性(P>0.05)。结论:1.妊娠合并ITP患者血清TPO水平显著高于GT患者,TPO水平可作为两种疾病鉴别诊断的参考指标。2.妊娠合并ITP患者血清TPO水平显著高于非妊娠期育龄女性ITP患者。3.大多数妊娠合并ITP患者骨髓巨核细胞数量减少,妊娠与非妊娠期ITP发病机制可能存在差异。第二部分:rhTPO治疗对ITP患者血小板去唾液酸化调控作用的研究目的:通过检测ITP患者和正常对照血小板去唾液酸化水平,分析ITP患者血小板去唾液酸化水平是否存在异常;检测ITP患者在接受重组人血小板生成素(recombinant human thrombopoietin, rhTPO)治疗前后的血小板去唾液酸化水平,并分析其与疗效的关系。从而探讨rhTPO用于ITP治疗时可能存在的作用机制。方法:1.入组22例一线治疗失败或复发的慢性ITP患者,治疗前收取患者外周血。同时入组24例健康志愿者作为正常对照,收取外周血,离心获取血小板。2.对入组的慢性ITP患者给予重组人血小板生成素(rhTPO)治疗(300U/kg/d),治疗起效后或14天仍不起效时停止rhTPO治疗,再次收取外周血,离心获取血小板。3.用PE-Cy5-CD41a单克隆抗体标记血小板,并同时使用FITC-RCA-1单克隆抗体标记血小板表面去唾液酸化后所暴露的β-Gal残基,流式细胞术检测RCA-I的平均荧光强度,并以此反映血小板表面去唾液酸化水平。结果:1.接受rhTPO治疗的慢性ITP患者,40.9%在14天内达到完全反应(complete response, CR)标准并停药,31.8%在14天后达到反应(response, R)标准,27.3%在治疗14天后仍无反应(no response, NR)。rhTPO治疗过程中,ITP患者均未出现严重不良反应。2.ITP患者血小板去唾液酸化水平显著高于正常对照组(P<0.01)。3.接受rhTPO治疗后,ITP患者血小板去唾液酸化水平降低,治疗前后存在显著性差异(P<0.01)。结论:1.血小板去唾液酸化水平升高可能与ITP的发病机制有关。2. rhTPO用于ITP患者的治疗安全且有效,并可显著降低ITP患者的血小板去唾液酸化水平,这可能是rhTPO治疗ITP的作用机制之一。