论文部分内容阅读
目的:卡介苗（bacillus Calmette-Guérin,BCG）是目前结核病预防唯一可用的疫苗。其相对于部分牛型结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis,MTB）或MTB标准株H37Rv缺失的基因片段称为RD区（region of deletion,RD区）。RD区编码的蛋白在MTB感染及诊疗中具有重要意义。MPT64蛋白由RD2区编码,具有较强的免疫原性。鉴于巨噬细胞是MTB的主要宿主细胞,且巨噬细胞极化则影响MTB感染后疾病的转归。本研究通过MTB MPT64重组蛋白对小鼠腹腔来源巨噬细胞极化的影响,进一步探索其通过何种巨噬细胞表面受体激活信号通路,从而阐述MPT64重组蛋白诱导巨噬细胞极化中的机制,为新型结核疫苗和诊断试剂盒的研发提供理论基础。方法:本研究以H37Rv基因组为模板,分别构建RD区基因编码的部分原核表达质粒、表达纯化相应RD蛋白,通过γ干扰素释放鉴定实验初步筛选出优势免疫原性抗原,经肽指纹图谱鉴定后,以筛选出优势免疫原分别免疫小鼠与刺激其腹腔巨噬细胞,酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测小鼠血清特异性抗体分型（Ig A、Ig G1与Ig G2a）与细胞因子（IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-23和TNF-α）表达。同时,通过指数富集配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）,将优势免疫原与磁珠偶联作为靶标,从随机寡核苷酸（DNA）文库中,筛选针对该优势免疫原的高亲和力的ss DNA适配子作为阻断工具;磁珠偶联优势免疫原免疫钓取与之相互作用的巨噬细胞膜蛋白表面受体,行质谱鉴定;随后使用信号通路抑制剂、筛选出的适配子处理腹腔巨噬细胞作对照,同时使用优势免疫原刺激,通过免疫印迹实验（western blotting,WB）和流式细胞术（flow cytometry,FCM）分别检测信号通路蛋白表达水平和巨噬细胞表面刺激分子的表达。结果:（1）本研究分别从RD区中克隆构建7种分泌型蛋白（rRv3874、rRv3875、r Rv1773、rMPT63、rMPT64、rMPT83及r CLE）原核表达质粒,转入大肠杆菌工程菌（E.coli BL21）中,经0.8m M异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylbeta-D-thiogalactoside,IPTG）诱导后呈可溶性表达（分子量约11k D、11k D、20k D、20k D、14k D、26k D和18k D）,使用Ni-NAT柱亲和层析纯化获得的重组蛋白,均能刺激T淋巴细胞产生高水平特异性的IFN-γ,其中r MPT64蛋白刺激T淋巴细胞后分泌IFN-γ显著高于其它蛋白（P＜0.001）。（2）rMPT64免疫小鼠4周后,小鼠血清中产生高效价的抗MPT64特异性抗体,经抗体分型试剂盒检测数据显示,特异性抗r MPT64 IgG1与IgG2a水平较PBS组升高且具有统计学差异（P＜0.05）;体外实验数据显示,r MPT64可刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌高水平的细胞因子（IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-23和TNF-α,P＜0.05）。（3）运用SELEX技术初步建立针对rMPT64蛋白适配子筛选的方法,经过15轮筛选,获得了25个MPT64重组蛋白的单克隆适配子。通过ELISA法分析其与MPT64重组蛋白的亲和力,获得了3个相对亲和力较高的适配子（F3、F8和F25）。生物素标记高亲和力适配子后,酶联寡聚核苷酸吸附试验（enzyme-linked Oligonucleotide assay,ELONA）结果显示3个适配子能够识别并结合相同或相似表位,筛选出其中结合力最高的适配子F3（P＜0.05）,作为下一步实验的阻断工具。（4）将MPT64重组蛋白与羧基磁珠偶联,质谱检测结果显示,MPT64重组蛋白能够通过巨噬细胞膜蛋白表面受体TLR2与巨噬细胞相互作用,因此对MPT64重组蛋白结合TLR2通路活化行Western blot检测。结果显示,15min时,100μg/m L MPT64重组蛋白浓度下p-Akt蛋白表达量较10μg/m L MPT64重组蛋白浓度明显增多,且均比空白对照组高,差异有统计学意义（P＜0.001）;p-Akt蛋白在MPT64重组蛋白刺激15min时开始增强,于30min时进一步增强。适配子封闭MPT64重组蛋白和抗TLR2单克隆抗体封闭TLR2后,磷酸化的Akt含量明显下降（P＜0.001）。这一结果确证MPT64重组蛋白F3适配子特异抑制信号通路PI3K/Akt,MPT64重组蛋白主要通过PI3K/Akt信号通路活化巨噬细胞。（5）细胞内流式细胞术分析显示,在相同时间范围内,随着MPT64重组蛋白刺激剂量的增大,CD80阳性细胞比例逐渐上升;相同剂量范围内,随着时间的增长,CD80阳性细胞比例逐渐上升。表明重组MPT64蛋白能够刺激巨噬细胞表达M1型巨噬细胞的标志性分子CD80,实验成功诱导了小鼠腹腔来源的M1型巨噬细胞,MPT64重组蛋白促进巨噬细胞向M1型样细胞转换。结论:MPT64重组蛋白能够诱导较强的细胞免疫应答,且可通过TLR2激活Akt磷酸化水平诱导巨噬细胞向M1型极化,有望开发成为结核病预防疫苗的候选分子。