第一部分:基于单细胞测序的早期妊娠蜕膜CD4+T细胞特征分析研究背景:母胎界面局部免疫微环境稳态对于建立并维持生理妊娠起到重要的调控作用。母体免疫系统可在妊娠后发生一系列适应性改变,建立对胎儿父系来源的半异体抗原正确的免疫识别、应答及耐受,以维持正常妊娠并促进胎儿的生长发育,避免发生流产、早产、死产等不良妊娠结局。子宫蜕膜中存在大量免疫细胞,主要包括NK细胞（～70%）、巨噬细胞（～20%）、T细胞（～10%）等,它们富集于母胎界面并具有独特的表型及功能,共同维持母胎界面免疫微环境稳态。目前对于蜕膜CD4+T细胞,尤其是免疫调节亚群调节性T细胞（Regulatory T cell,Treg）的研究较少,尚缺少蜕膜组织特异性Treg相关的测序数据。相较于外周血,蜕膜Treg 比例富集并持续存在于整个妊娠过程,推测其可能通过发挥负向免疫调控功能维持母胎免疫耐受,但其来源、组织特异性表型、细胞内部异质性及功能特征仍有待探究。因此,本研究第一部分通过10x Genomics平台对人正常早期妊娠的蜕膜组织及配对外周血中的免疫细胞进行单细胞转录组及免疫组库测序,围绕早期妊娠蜕膜CD4+T细胞展开研究,并重点关注蜕膜Treg细胞特征。研究目的:通过单细胞转录组及免疫组库测序,探究早期妊娠蜕膜CD4+T细胞基因表达谱及亚群分布,明确蜕膜组织特异性Treg表型特征。研究方法:收集8例正常早期妊娠蜕膜组织及配对外周血样本,通过流式细胞分选技术富集CD4+T细胞进行10x Genomics 5’端转录组及TCRV（D）J测序。Cell Ranger进行数据质控及过滤,Seurat筛选高变基因进行降维聚类及差异基因表达分析,流式细胞分析技术在蛋白水平验证细胞群表型特征,STARTRAC算法分析T细胞克隆扩增情况。研究结果:（1）构建早期妊娠蜕膜CD4+T细胞图谱鉴定出蜕膜及配对外周血CD4+T细胞共17个亚群,主要包括原始T细胞、蜕膜静息T细胞、效应T细胞、蜕膜Th1-like细胞、Treg细胞、细胞毒T细胞、自然杀伤 T 细胞（Natural killer T cell,NKT）、Ⅰ 型调节性 T 细胞（Type 1 regulatory T cell,Tr1）等,且蜕膜与外周血来源的细胞群之间基因表达差异大,RO/E值示多数亚群细胞具有明显的来源偏好性。（2）蜕膜特异性Treg细胞表型特征分析对蜕膜Treg差异性表达基因分析,发现蜕膜Treg相较外周血Treg显著高表达TNFRSF4、ICOS、TNFRSF18、TIGIT、CTLA4等158 个基因,显著低表达 SELL、LEF1、TXNIP、TCF7、NOSIP等 25 个基因,STARTRAC 扩增指数示蜕膜 Treg扩增活跃,提示蜕膜Treg特异性高活化及强抑制的特性。流式细胞术检测早期妊娠蜕膜及外周血样本,结果显示蜕膜Treg相较外周血Treg显著低表达原始T相关标志物CD45RA、SELL;显著高表达共刺激分子TNFRSF4、ICOS、TNFRSF18,共抑制分子TIGIT、PD1,转录因子IKZF4、TOX、BATF,活化相关分子CD25、CD39,及增殖相关分子Ki67,与转录水平结果一致均提示蜕膜Treg特异性高活化及强抑制的特性。筛选蜕膜Treg核心特征基因与既往测序数据比对,发现91.7%核心基因与肺癌、结肠癌、肝癌组织Treg特征重合。（3）蜕膜非Treg细胞特性及验证收集早期妊娠蜕膜组织验证Th细胞、NKT细胞及细胞毒T细胞特性,结果显示早期妊娠（6-8周）蜕膜组织Th细胞以T-bet+IFN-γ+Th1型细胞为主;NKT细胞表型与蜕膜NK细胞特征相似;EOMES+GZMK+细胞毒T细胞高表达耗竭分子 TIGIT、PD1 及 TOX。研究结论:绘制早期妊娠蜕膜CD4+T细胞图谱,明确各亚群细胞妊娠相关的表型特征。蜕膜Treg具有与肿瘤浸润Treg相似的特异性高活化强抑制表型,提示蜕膜Treg可能参与维持母胎界面免疫耐受。第二部分:蜕膜CCR8+Treg新亚群的鉴定及表型特征探究研究背景:第一部分研究中我们分析并鉴定了蜕膜特异性Treg细胞,其特殊的高活化强抑制表型提示其在母胎免疫耐受中的潜在重要作用。Treg是高度异质性的细胞群,具有不同表型的亚群在各组织器官病理生理过程中发挥不同作用。然而,受限于较低的细胞数目和比例,目前关于蜕膜Treg异质性亚群的探究仍十分匮乏。基于第一部分单细胞测序结果,蜕膜Treg存在两个亚群,其基因表达特征存在明显差异;那么能否筛选出亚群特征性标记物,对于蜕膜Treg特性及功能认知至关重要。因此,本部分研究探究蜕膜Treg亚群的特征性标记物及功能表型,分析并预测其来源及分化路径,为深入研究蜕膜免疫微环境与母-胎免疫耐受奠定理论基础。研究目的:筛选蜕膜Treg亚群特征性标记物并探究其功能性表型,分析并预测其来源及分化路径。研究方法:收集早期妊娠蜕膜及外周血,流式细胞术筛选蜕膜Treg亚群特征性标记物并检测其多种功能分子相对表达情况。STARTRAC算法通过TCR文库数据分析Treg细胞扩增、迁移及转化情况,RNA速度分析预测蜕膜Treg来源及分化路径。研究结果:（1）蜕膜CCR8+Treg亚群鉴定及功能表型检测通过差异基因分析发现,蜕膜Treg其中一个亚群细胞特异性高表达趋化因子受体 CCR8 基因及 TNFRSF4、TNFRSF9、TNFRSF18、TIGIT、CTLA4 等 Treg 活化抑制功能相关基因。进一步通过流式细胞术在蛋白水平验证CCR8可以作为蜕膜Treg分群标志,CCR8+Treg亚群特异性富集于早期妊娠蜕膜组织。结合测序数据检测相关功能分子表达情况发现,相较于CCR8-Treg及Tconv,蜕膜CCR8+Treg显著低表达原始T相关标志物SELL;显著高表达共刺激分子TNFRSF4、ICOS、TNFRSF18,共抑制分子 TIGIT、PD1、CTLA4,转录因子 IKZF4、TOX,活化相关分子CD25、CD39,以及趋化因子受体CCR4、CXCR6。以上结果提示CCR8+Treg亚群可能是蜕膜Treg中起主要作用的功能亚群。（2）蜕膜CCR8+Treg来源及分化分析STARTRAC迁移指数示蜕膜CCR8+Treg具有组织驻留性,转化指数示蜕膜CCR8+Treg与CCR8-Treg间转化活跃,且与外周血Treg、组织非Treg细胞间有一定程度转化关系。RNA速率分析预测蜕膜Treg来源及分化方向,结果显示蜕膜CCR8+Treg可能由外周Treg募集或蜕膜静息T细胞诱导分化形成。研究结论:首次鉴定蜕膜CCR8+Treg亚群并证实其功能表型,提示其为蜕膜Treg中起主要作用的功能亚群,推测蜕膜CCR8+Treg可能通过外周Treg募集或组织静息T诱导,经由微环境驯化形成。第三部分:蜕膜CCR8+Treg参与维持母-胎免疫耐受的机制研究研究背景:CCR8分子在肿瘤浸润Treg细胞中特异性表达并显著富集,CCR8+Treg是肿瘤组织中的“主导”Treg亚群细胞,其强大的免疫负向调控作用参与介导肿瘤细胞免疫逃逸,靶向CCR8特异性清除肿瘤CCR8+Treg可显著抑制小鼠肿瘤生长。然而目前尚未有关于蜕膜CCR8+Treg的报道,其是否亦通过免疫负向调控作用参与维持母-胎免疫耐受尚不明确。第二部分研究中我们鉴定出蜕膜CCR8+Treg亚群,其功能分子表型提示其为蜕膜Treg主要功能亚群。本部分研究通过纳入复发性流产（recurrent pregnancy loss,RPL）患者,并构建相关小鼠模型,探究蜕膜CCR8+Treg参与维持母-胎免疫耐受的相关机制。研究目的:检测RPL患者及自然流产模型小鼠蜕膜CCR8+Treg变化,明确其与母-胎耐受失衡的关联性。通过anti-CCR8抗体处理孕鼠,观察胚胎丢失率、活胎数等指标变化,检测蜕膜微环境其他淋巴细胞亚群改变,进一步明确CCR8+Treg参与介导母-胎免疫耐受的机制。研究方法:流式细胞术检测RPL患者蜕膜CCR8+Treg变化。构建CBA/J小鼠自然流产模型,观察胚胎丢失率、活胎数、胎鼠体重等指标,流式细胞术检测蜕膜CCR8+Treg变化。应用anti-CCR8抗体处理孕鼠,观察流产相关表型,流式细胞术检测蜕膜微环境中其他淋巴细胞亚群改变。研究结果:（1）RPL患者及自然流产模型孕鼠存在蜕膜CCR8+Treg失衡与健康早期妊娠者相比,RPL患者蜕膜CCR8+Treg显著降低,但其功能分子表达情况无显著差异。与RPL患者一致,CBA/J自然流产组小鼠相较对照组蜕膜CCR8+Treg显著降低,功能分子表达情况无显著差异。（2）CCR8抗体处理显著改变孕鼠蜕膜免疫微环境并增加流产率通过对正常妊娠组孕鼠注射anti-CCR8单克隆抗体特异性降低蜕膜CCR8+Treg,E12.5观察妊娠表型发现anti-CCR8抗体处理组孕鼠胚胎吸收率显著升高、活胎数显著降低。检测蜕膜其他免疫细胞发现,anti-CCR8抗体处理组孕鼠蜕膜中杀伤性的NK（natural killer cell）细胞及CD8+T细胞显著增加。研究结论:蜕膜CCR8+Treg参与维持母-胎免疫耐受,其降低与RPL疾病发生相关;蜕膜CCR8+Treg减少可能通过增加蜕膜杀伤性的免疫细胞导致母-胎免疫耐受失衡引发流产。