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水稻（Oryza sativa L.）产量对我国粮食安全和社会安定产生重要影响。二化螟（Chilo suppressalis Walker,SSB）是水稻主要害虫之一。因此,有效防治二化螟危害以提高水稻总产量具有重要的现实意义。使用杀虫剂是目前主流的害虫防治策略,但其对环境的影响和害虫抗药性的产生使人们意识到必须寻找可替代且生态友好的抗虫策略。RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术的发展为害虫防治提供了新思路。目前,基于昆虫内源微小RNA（microRNA,miRNA）的RNAi抗虫策略对环境和非靶标生物相对友好,并且可以针对特定昆虫使用特异的基因资源,因此值得深入探索。本研究将二化螟中肠组织特异性表达的miRNA克隆并构建到人工miRNA（artificial microRNA,amiRNA）表达载体中。利用农杆菌介导的遗传转化方法将该表达载体导入水稻,得到miRNA高水平表达的转基因水稻植株,并通过水稻茎杆饲喂试验鉴定出具备抗虫潜力的miRNA。得到的主要结果如下:（1）获得二化螟中肠特异性表达的候选miRNA:从本实验室前期得到的106个新鉴定的二化螟miRNA（novel miRNA）中筛选获得11个中肠组织特异性表达的novel miRNA（分别命名为csu-novel-miR36、csu-novel-miR38、csu-novel-miR47、csu-novel-miR51、csu-novel-miR53、csu-novel-miR57、csu-novel-miR67、csu-novel-miR78、csu-novel-miR82、csu-novel-miR92和csu-novel-miR96）,作为目标miRNA开展后续研究。（2）转基因材料的创制及二化螟抗性鉴定:将上述11个miRNA序列构建到amiRNA表达载体上,通过农杆菌介导的遗传转化方法导入到水稻品种中花11中,获得T0代转基因水稻,收集miRNA表达量相对较高的孕穗期转基因水稻的茎秆饲喂二化螟,统计饲喂7 d及10 d后的二化螟幼虫体重以评估其抗虫性。结果显示,有3个转基因水稻家系在饲喂二化螟7 d和10 d后,都导致二化螟幼虫平均体重下降。其中转csu-novel-miR53基因水稻（命名为csu-53）茎秆饲喂初孵二化螟幼虫7 d后,幼虫平均体重比对照组低21.99%;饲喂10 d后,幼虫平均体重比对照组低31.94%,并具有显著差异。而转csu-novel-miR78和csu-novel-miR82基因水稻（命名为csu-78和csu-82）茎秆饲喂初孵二化螟幼虫7 d后,幼虫平均体重比对照组分别低6.02%和12.77%;饲喂10 d后,幼虫平均体重比对照组分别低22.78%和20.35%,统计无显著差异。以上结果表明,csu-53转基因水稻的抗虫效果相对更好。同时,用含有模拟生物体内源而人工合成的miRNAs（mimicking miRNAs,miRNA mimics）的饲料饲喂初孵二化螟,其抗虫效果与T0代csu-53转基因材料基本一致。用添加csu-novel-miR53 mimics激动剂（agomir-53）的饲料饲喂二化螟初孵幼虫5 d后,幼虫平均体重比对照（agomir-NC）低47.91%,死亡率比对照高46.46%;饲喂10 d后,幼虫平均体重比对照低21.80%,死亡率比对照高39.35%,均具有显著差异。而饲喂添加了csu-novel-miR53 mimics抑制剂（antagomir）的饲料后,幼虫平均体重和死亡率相比对照（antagomir-NC）均无显著差异。（3）单拷贝插入纯合csu-53转基因水稻家系的筛选及二化螟抗性鉴定:通过拷贝数检测、表达量检测及发芽试验,筛选出3个miRNA高表达的单拷贝纯合转基因水稻家系,命名为CS-2、CS-9和CS-27。用这3个水稻家系的茎杆进行二化螟连续饲喂试验,结果显示,从第5 d开始,二化螟整个幼虫期的平均体重均较对照组轻,平均化蛹时间比对照延长约7 d,平均蛹重比对照降低16.5%,平均羽化率比对照降低43.2%,平均蛹重比对照降低16.5%,平均羽化率比对照降低43.2%,均具有显著差异。实验结果表明:csu-53转基因植株可延缓二化螟幼虫的生长发育。（4）csu-53转基因水稻家系的非靶标害虫抗性鉴定:对稻纵卷叶螟（Cnaphalocrocis medinalis）和褐飞虱（Nilaparvata lugens）的抗虫鉴定结果显示,csu-53转基因水稻家系对稻纵卷叶螟和褐飞虱均无抗性。（5）csu-novel-miR53靶基因的鉴定:通过对饲喂csu-53转基因水稻茎杆的试验组和对照组二化螟中肠转录组测序分析,鉴定到28个表达水平具有显著性差异的基因。利用表达量检测结合靶标位点预测分析,对上述28个候选靶标基因进行验证,最终推测DN90065＿c0＿g12可能是csu-novel-miR53的靶标基因。利用DN90065＿c0＿g12的序列设计该基因的dsRNA序列,使用含有ds DN90065＿c0＿g12的饲料饲喂二化螟初孵幼虫。饲喂7 d和10 d后,幼虫平均体重与对照相比分别下降了31.7%和41.3%;同时二化螟DN90065＿c0＿g12基因也被显著沉默,表达量分别下降78.6%和39.4%。以上结果表明:抑制DN90065＿c0＿g12的表达量具有与饲喂csu-novel-miR53具有相似的抗虫效果。总之,本研究发现了二化螟中肠特异miRNA csu-novel-miR53及其潜在靶基因可用于培育抗二化螟转基因水稻,并且得到了3个抗二化螟单拷贝纯合转基因水稻家系。本研究结果为从昆虫中鉴定重要内源miRNA并以此开发抗虫转基因作物提供了理论依据。