[目的]由各种原因引起的骨缺损性疾病逐年增加,严重影响着人类的生活质量。在临床治疗中,自体骨移植仍被认为是金标准,但供体来源不足的问题仍难以解决,而在移植过程中的侵入性操作往往会给患者带来无法弥补的损伤。基于生物材料的组织工程已经成为骨修复领域的一个热点,因为功能材料可通过有机组合的方式构建智能平台,实现骨缺损的高效修复。基于以上关键问题,为分化源细胞提供一个类似于“天然磁石”的中心平台,使骨骼相关干细胞能主动富集并定植于骨缺损处,是一种具有重大应用潜力的策略。这种方法可以依靠内源性修复,规避侵入性手术的损害,将为临床骨缺损治疗带来新的机遇。在本研究中,我们拟在制备一种具有良好生物相容性、原位募集干细胞并维持细胞增殖与分化平衡的新型3D水凝胶,在此基础上验证水凝胶的功能特性,希望为临床上骨缺损的快速修复提供一种新的选择。[方法]1、利用前期已经筛选并合成的SDF-1类似物小肽（S-PE）,用CCK-8方法检测S-PE对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的细胞毒性;EDU染色法、Cystain DNA一步法检测S-PE对大鼠BMSCs细胞增殖的影响;Annexin V-FITC法检测S-PE对大鼠BMSCs细胞凋亡的影响;Western-blot法评价S-PE对BMSCs中CXCR4表达和对Wnt/β-catenin信号通路的影响;分别用Western-blot法检测成骨分化标志物OPG、OSX的表达和茜素红染色评价S-PE对大鼠BMSCs成骨分化能力的影响;Transwell法检测S-PE对大鼠BMSCs细胞迁移诱导的作用。2、利用酰胺化反应将S-PE接枝到壳聚糖（CS）上实现S-PE功能化,合成产物（CS-PE）分别用傅里叶红外变换光谱（FT-IR）、紫外-可见光（UV-vis）、和核磁共振氢谱（1H NMR）对合成的CS-PE进行表征;采取CCK-8方法筛选出CS和CS-PE有效使用浓度;Live/Dead染色法检测CS-PE对BMSCs细胞的增殖的影响;Transwell法检测CS-PE对大鼠BMSCs细胞迁移诱导的作用。3、将CS分别与不同浓度的甘油磷酸钠（GP）按比例混合后,分别测定凝胶时间和pH值,选出最佳GP浓度;将CS、CS-PE与GP、大鼠Ⅰ型鼠尾胶原和Wnt3a按顺序、比例混合分别制备成具有温敏性可变形的CS/GP水凝胶、CS-PE/GP水凝胶、和CS-PE/GP/Wnt3a水凝胶,分别测定凝胶时间和pH值,扫描电镜（SEM）对水凝胶进行形貌表征。4、Live/Dead染色法检测CS-PE/GP/Wnt3a水凝胶对大鼠BMSCs细胞毒性和增殖的影响;Transwell法检测CS-PE/GP/Wnt3a水凝胶对大鼠BMSCs细胞迁移诱导的作用;分别将大鼠BMSCs接种到含Wnt3a的Ⅰ型胶原平台、CS-PE/GP水凝胶和CS-PE/GP/Wnt3a水凝胶中,成骨分化诱导5-7天,免疫荧光法检测aPKCC、Numb和OPN的表达以评估水凝胶中不对称细胞（ACD）分裂效果。5、将水凝胶经皮下注射到小鼠,7天后取出材料并制备成单细胞悬液,分别用CD45、F4/80和CD206标记样品,流式细胞术分析水凝胶中巨噬细胞的浸润、极化;免疫荧光法检测组织中M1巨噬细胞标志物Nos2和M2巨噬细胞标志物Arg1的表达。6、将水凝胶分别注射到大鼠和小鼠皮下,7天后取出材料并制备成单细胞悬液,大鼠细胞用CD44、CD45、CD29和CD90标记,小鼠细胞用CD45、CD54和CD90标记,流式细胞术分析水凝胶中招募的间充质干细胞比例;免疫荧光法检测组织中干细胞标志物CD54的表达。7、通过建立大鼠临界颅骨缺损模型评估水凝胶在体内招募内源性间充质干细胞及促进骨组织再生的能力,全自动生化分析仪检测术后8周血清中ALT,AST,TBIL,γGTT,ALP,BUN和CREA的表达;HE染色检查各组大鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的病理改变;用Micro-CT评估骨修复情况;对骨组织切片分别行HE和Masson染色观察新生骨的结构;利用免疫荧光的方法检测M2型巨噬细胞标志蛋白Argl和新生骨的标志蛋白SOST在颅骨缺损区组织的表达。[结果]1、提取并鉴定了大鼠原代BMSCs;经CCK8结果表明SDF-1在100ng/mL和S-PE在0.4mM时BMSCs细胞活力最大,EDU结果显示SDF-1和S-PE具有促进细胞增殖的作用;对细胞周期和细胞凋亡的结果发现SDF-1和S-PE对细胞周期无阻滞作用,对凋亡无促进作用;与SDF-1相比,S-PE可使BMSCs表达更多的CXCR4、p-GSK3β和β-catenin,免疫荧光可见S-PE可促进β-catenin入核;Western-blot结果可见OPG、OSX的表达增加（P＜0.05）;茜素红染色可见加入S-PE组的细胞能形成更多的矿化结节;Transwell结果发现S-PE对大鼠BMSCs细胞明显的迁移诱导作用。2、利用酰胺化反应成功将S-PE接枝到CS上,并用FT-IR、UV-vis和1H NMR证实了 CS-PE成功合成,CCK8结果发现2.5%CS-PE时BMSCs细胞活性最高,Live/Dead染色结果显示CS-PE对BMSCs细胞无毒,细胞相容性好。3、根据CS与GP的凝胶时间和pH值,选取60%GP浓度合成水凝胶;通过CS、CS-PE分别与GP、大鼠Ⅰ型鼠尾胶原和Wnt3a按比例分别制备了 CS/GP-Gel、CS-PE/GP-Gel 和 CS-PE/GP/Wnt3a-Gel,在 37℃时可以形成水凝胶,利用SEM证实了合成的水凝胶具有3D网状结构;4、Live/Dead染色结果显示三种水凝胶对BMSCs无毒,具有较好的细胞相容性;Transwell结果可见CS-PE/GP/Wnt3a-Gel对大鼠BMSCs细胞的迁移诱导作用最好（P＜0.001）;5、与对照组相比较,含Wnt3a的胶原平台上可见更多的BMSCs发生ACD现象;与CS-PE/GP/Wnt3a-Ge1组相比较,在CS-PE/GP/Wnt3a-Gel上可见大量的BMSCs中aPKCζ富集于胞体的一端,也观察到OPN在胞体的一端富集,而Numb在细胞分裂过程中分布没有差异。6、CS/GP-Gel、CS-PE/GP-Gel 和 CS-PE/GP/Wnt3a-Gel 组中均有粒细胞的浸润,在CS-PE/GP/Wnt3a-Gel组中浸润的粒细胞有22.02%为巨噬细胞,与CS/GP-Gel组（9.8%）、CS-PE/GP-Gel组（17.13%）相比具有统计学意义;在各组中浸润的巨噬细胞中分别有13.77%、27.95%、34.03%为M2型巨噬细胞,CS-PE/GP/Wnt3a-Gel组相比较于其它两组均具有统计学意义;组织免疫荧光结果显示 CS-PE/GP/Wnt3a-Gel 组的 Nos2 表达量较 CS/GP-Gel 和 CS-PE/GP-Gel 组中的比例少,而Argl表达量明显高于其它两组,并具有统计学意义。7、在大鼠皮下注射各组水凝胶7天后,CS-PE/GP-Gel和CS-PE/GP/Wnt3a-Gel组中均较CS/GP-Gel组能招募更多的间充质干细胞（P＜0.05,P＜0.001）,且CS-PE/GP/Wnt3a-Gel组相较于CS-PE/GP-Gel组也具有更好的主动招募干细胞能力（P＜0.01）;在小鼠中 CS-PE/GP/Wnt3a-Gel 组相较于 CS-PE/GP-Gel 和 CS-PE/GP/Wnt3a-Gel组其招募干细胞能力最强（P＜0.01）;免疫荧光结果也证实CD54 在 CS-PE/GP/Wnt3a-Gel 组中的表达均高于 CS-PE/GP-Gel 和 CS-PE/GP/Wnt3a-Gel 组。8、体内实验表明,成功构建大鼠临界颅骨缺损模型后,术后8周大鼠血清中ALT,AST,TBIL,γGTT,ALP,BUN和CREA的表达变化无差异;大鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏等未见病理改变。Micro-CT结果显示植入CS-PE/GP/Wnt3a-Gel组的大鼠颅骨修复效果最好,定量分析剩余缺损面积后发现相较于NC和CS/GP-Gel组,CS-PE/GP/Wnt3a-Gel组呈现出更多的骨形成。HE染色结果显示在新生骨区域的矿化具有健康骨的组织学特征,且与对照组相比,CS-PE/GP-Gel组和CS-PE/GP/Wnt3a-Gel组的缺损区有更多的新生骨形成;Masson三色染色结果显示经CS-PE/GP/Wnt3a-Gel治疗的缺损边缘可见形成了大量的类骨质基质,CS-PE/GP-Gel次之,对照组和CS/GP-Gel组的缺损边缘形成的较多的纤维软组织,骨愈合最小;免疫荧光染色发现在CS-PE/GP/Wnt3a-Gel组中可见到比其他三组更多的表达Arg1和SOST的阳性细胞。[结论]1、S-PE可发挥和SDF-1在招募间充质干细胞中类似的作用,具有较低的细胞毒性,对BMSCs增殖和成骨分化具有促进作用,可以作为一种新的功能单元负载在生物材料中而进一步发挥作用。2、CS-PE生物相容性好且具有招募干细胞作用,CS-PE/GP/Wnt3a可变形水凝胶具有温敏性、合适的细胞生态位环境、原位招募间充质干细胞的能力,较低的炎症反应,可早期启动组织修复;热响应性相变使水凝胶能填充不规则缺损区域,可维持动态补充干细胞池,并通过Wnt3a诱导ACD可实现更快速的骨修复,具有较好的应用潜力。