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蒽醌类化合物主要存在于虎杖、大黄、芦荟等多种中草药中,具有抗菌、降血压、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性,有的药物已应用于临床。天然的蒽醌类化合物存在含量低,提取困难、难分离,有心脏毒性等缺点。因此,结合抗肿瘤药物的作用原理和机制以及蒽醌类衍生物的构效关系,合成高效低毒的衍生物是目前开发新药的重要途径。本课题组前期设计合成了 7种具有酰胺键的蒽醌类衍生物,并通过MTT法检测这7种蒽醌衍生物对8种肿瘤细胞株的增殖抑制作用,结果显示:取代基团为甘氨酸,亮氨酸,脯氨酸,缬氨酸,苯丙氨酸这5种化合物可以明显的抑制食管癌细胞株EC9706、胆管癌细胞株QBC-939、肝癌细胞株HepG2、胃癌细胞株SGC-7901、结肠癌细胞株HCT116等肿瘤细胞的增殖,其中取代基团为亮氨酸和缬氨酸的蒽醌衍生物(分别标记为:C2和C3)对HCT116细胞增殖的抑制率最明显。本文主要探究了 C2、C3对人结肠癌HCT116细胞的作用及其机制,研究内容如下:1、为了检测C2和C3与生物大分子相互作用,通过紫外光谱、荧光光谱、圆二色谱等方法检测了 C2和C3与牛血清白蛋白(BSA)和小牛胸腺DNA(CT-DNA)的相互作用,实验结果表明:两种衍生物能与BSA相结合,使其内源荧光发生静态猝灭,并且破坏了 BSA的α-螺旋结构;通过嵌插作用与DNA相互作用,减弱了其碱基间的相互作用。C2和C3与BSA和DNA相互作用显著,这为进一步检测C2和C3的抗癌活性奠定了理论基础。2、采用MTT法检测C2和C3对人结肠癌HCT116细胞增殖的抑制作用,呈剂量和时间依赖性。分别采用不同浓度的两种衍生物作用HCT116细胞,用普通倒置显微镜观察作用24 h后,细胞形态的变化,发现随着衍生物浓度的增大,细胞发生显著皱缩变圆且细胞间距增大;用DAPI染色法观察细胞核形态的变化,可见细胞核固缩,细胞核呈现大小和形态不同的现象。通过流式细胞术检测两种衍生物对HCT116细胞凋亡和周期的影响,发现细胞周期被阻滞,出现凋亡现象,但是凋亡现象不十分明显,猜测衍生物可能诱导细胞发生自噬。通过MDC染色和GFP-LC3定位检测,发现两种衍生物能显著诱导HCT116细胞发生自噬。两种化合物结构相似,作用机理相同,以C3对细胞的作用为例,检测了一定浓度C3作用细胞后,随着作用时间的变化,凋亡相关蛋白Cleaved PARP、Cleaved caspase9、Cleaved caspase3、p-Bcl-2、p-Bcl-xL、Bax 以及 Bcl-2、Bcl-xL 的变化情况。结果发现凋亡相关蛋白 Cleaved PARP、Cleaved caspase 9、Cleaved caspase 3、p-Bcl-2、p-Bcl-xL、Bax表达量明显增多,而Bcl-2、Bcl-xL的表达量显著降低,由此表明C3能显著诱导HCT116细胞发生凋亡;并且自噬相关蛋白P62的表达量显著降低,LC3Ⅱ、Beclin-1表达量明显升高,可知C3也能显著诱导HCT116细胞发生自噬。3、为了进一步检测C3诱导HCT116细胞发生自噬和凋亡的机理,通过流式细胞术检测不同浓度C3作用于HCT116细胞后,ROS水平的变化。结果显示,随C3浓度的升高,ROS水平显著增高;当使用ROS的特异抑制剂NAC和C3共同作用后,与单独C3作用相比,ROS水平显著降低。用相同浓度的C3处理HCT116细胞后,采用Western Blot技术检测发现p-JNK1和p-JNK2蛋白的表达量升高且呈时间依赖性。当NAC抑制ROS后,p-JNK1和p-JNK2蛋白表达量显著降低。因此,C3诱导HCT116细胞发生自噬和凋亡,很可能是通过ROS-JNK信号通路。当用JNK磷酸化的特异性抑制剂SP500125和C3共同作用HCT116细胞后,与单独C3作用相比,Western Blot技术分析发现Cleaved caspase 9、Cleaved caspase 3、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ、Beclin-1的表达量显著降低;经MTT检测后,发现细胞活力显著升高。JNK1/2siRNA干扰后其结果一致,可见C3可能是通过ROS-JNK信号通路诱导HCT116细胞发生自噬和凋亡。上述结果为探究酰胺蒽醌衍生物抗癌活性的研究奠定了基础,也为新药的开发提供了科学依据。