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水禽细小病毒（waterfowl parvoviruses）分为番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus,MDPV）和鹅细小病毒（goose parvovirus,GPV）,主要感染雏水禽（雏鹅与雏番鸭等）。MDPV和GPV均为我国首次分离报道,MDPV和GPV基因组全长均约为5.100 kb,编码两个大的蛋白:与复制相关的蛋白NS和与病毒抗原相关的蛋白VP。MDPV和GPV基因组核苷酸同源性较高,并存在部分抗原交叉反应,容易给临床诊断造成误诊误判。近年来,随着对水禽细小病毒研究的深入,发现水禽细小病毒在基因型、宿主致病性和致病力等方面均出现变异,给我国水禽养殖业造成极大的损失。本论文中,通过对水禽细小病毒（MDPV和GPV）非结构蛋白NS基因编码区核苷酸序列进行分析比对发现,在MDPV的NS基因编码区973-978位（GAATTC）存在EcoR Ⅰ酶切位点,而GPV在此处（973-978位）没有EcoR Ⅰ酶切位点。通过设计一组跨过该差异位点的PCR引物,该引物可同时对MDPV和GPV基因组核酸DNA进行PCR扩增,可获得长度均为641 nt的目的片段。对PCR产物进行EcoR Ⅰ内切酶酶切发现,MDPV的PCR产物可被EcoR Ⅰ酶切成463 nt和178 nt大小两个片段,而GPV的PCR产物被EcoR Ⅰ酶切后片段大小不变,仍为641 nt。通过和组织直接扩增PCR试剂盒与快速酶酶切（酶切仅需5min）结合使用,可有效用于对MDPV和GPV感染快速鉴别诊断研究,尤其对MDPV和GPV共感染现象可进行快速准确诊断。随后,对MDPV和GPV基因组序列分析比对发现,MDPV和GPV的NS基因编码区核苷酸序列存在种属间特异性连续多碱基差异。结合基于SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的溶解曲线Tm值和所扩增的目的片段的GC含量正相关的原理,设计一组基于SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR扩增的引物,该引物可同时对MDPV和GPV进行有效扩增,且扩增区域（PCR产物编码区）存在GC含量差异,实时荧光定量PCR反应后生成溶解温度Tm值出现差异。该方法可在实时荧光定量PCR扩增过程结束后,根据生成的溶解曲线Tm值差异对对MDPV和GPV感染进行直接“可视化”观察。通过和建立的PCR-RFLP鉴别诊断方法的检测结果比对分析发现,经PCR-RFLP检测为阳性的样品,经实时荧光定量PCR鉴别诊断方法均为阳性,符合率为100%。为明确当前水禽中流行的水禽细小病毒基因组特征。利用非免疫番鸭胚进行病毒分离,共分离到水禽细小病毒22株。经PCR-RFLP检测为GPV毒株10株,MDPV毒株12株（经典型4株和新型8株）。本研究共测定11株鹅细小病毒（其中鹅源4株、番鸭源5株、鸿雁源1株和弱毒活疫苗株1株）、5株经典型MDPV（其中番鸭源4株和弱毒活疫苗株1株）、8株新型鸭细小病毒（novel Moscovy.duck parvovirus,N-MDPV）全基因组序列。鹅细小病毒基因组序列测定和分析表明,11株GPV基因组序列大小在5 050 nt～5 106 nt之间,GPV分离株相互之间核苷酸同源性在93.4%～99.4%之间。对GPV遗传进化分析发现,GPV在基因组、NS基因和VP基因的遗传进化上呈现复杂多样性,当前在中国大陆地区流行GPV强毒力遗传进化亚分支。番鸭细小病毒（MDPV和N-MDPV）基因组序列测定和分析表明,5株经典型MDPV基因组大小在5 017 nt～5 133 nt之间,和经典MDPV代表株（FM株）核苷酸同源性在98.7%～99.3%;和GPV代表株（B株）的核苷酸同源在81.9%～82.2%。遗传进化分析发现,MDPV遗传进化出现新型番鸭细小病毒（基因重组型）（N-MDPV）遗传进化亚分支。对8株N-MDPV基因组序列测定和分析表明,N-MDPV在基因组全长上具有MDPV相似的基因组骨架。8株N-MDPV基因组大小在4977 nt～5129 nt之间,相互之间的核苷酸同源性在98.0%以上;和经典MDPV代表株（FM株）核苷酸同源性在90.8%～95.0%之间;和GPV代表株（B株）核苷酸同源性在82.2%～85.3%之间。对8株N-MDPV基因组进行Simplot重组分析发现,8株N-MDPV基因组均存在2处大片段的MDPV和GPV基因重组现象。遗传进化表明,新发N-MDPV在遗传进化上呈现不同于经典型MDPV的遗传进化特点,其在全基因组和VP1基因的遗传进化和经典MDPV较近,但其VP3基因遗传进化却处于GPV遗传进化分支,且已呈现出独特的遗传进化分支。对N-MDPV的致病性研究发现,部分耐过番鸭表现出短喙与侏儒综合征（short beak and dwarfism syndrome,SBDS）。结合基因组特征（核苷酸比较、重组分析和遗传进化分析）和致病性差异,本研究建议重新设立一个鸭细小病毒新种（Species）——新型番鸭细小病毒,以区别于经典番鸭细小病毒和鹅细小病毒。为进一步开展N-MDPV的致病机制研究,本研究结合水禽细小病毒基因组特点——单链DNA极易退火形成双链,将N-MDPV双链解链后获得DNA单链,通过末端加A尾获得粘性末端,将其克隆插入pBluescript Ⅱ KS（+）载体的EcoRV位点,获得N-MDPV基因组DNA单链的全长感染性克隆质粒pBSK-N-MDPV。同时,运用定点无义突变技术将N-MDPV具有分子标签的EcoR Ⅰ酶切位点突变为BamHⅠ酶切位点（MDPV和GPV基因组均无此酶切位点）,获得具有遗传选择标记的感染性克隆质粒pBSK-N-MDPV-BamH Ⅰ,转染番鸭胚后拯救出新型鸭细小病毒（r N-MDPV）,经酶切位点鉴定、荧光显微镜观察和序列测定验证,拯救出具有生物学活性的新型鸭细小病毒（r N-MDPV）,为开展N-MDPV后续研究提供实验操作平台。