食源性致病菌是影响食品安全的重要因素之一。传统培养法、免疫学方法和分子生物学方法都已无法满足人们对食品中致病菌快速、灵敏检测的需求。传统免疫磁分离技术作为一种快速、高效的前处理手段,在致病菌的快速检测中展示出良好的应用价值;但抗体存在价格不菲、制备复杂和保存困难等缺点,极大地限制了免疫磁分离在实际检测中的广泛应用。万古霉素(vancomycin,Van)是一种糖肽类抗生素,其与目标菌的结合力与抗原-抗体结合力相当,具有稳定性好、易制备和保存等优点,近年来被广泛应用于革兰氏阳性菌的分离检测。本文以Van作为靶向分子,结合磁分离技术对食品样本中的金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌进行富集;随后以多重PCR、多重荧光定量PCR(m-qPCR)和流式细胞术(FCM)三种技术分别用于目标菌的检测。各章节内容分述如下:第一章:综述了万古霉素在食源性致病菌检测中的应用。第二章:建立了万古霉素功能化的聚乙二醇化磁珠(Van-PMs)结合PCR对生菜样本中低浓度下单增李斯特菌进行富集和检测的方法。以Van-PMs作为通用分子探针用于捕获单增李斯特菌,其中PEG作为分子臂,有助于Van接近单增李斯特菌表面的D-丙氨酰-D-丙氨酸(D-Ala-D-Ala)分子。在最适条件下,本文构建的Van-PMs复合物,用于10 m L体系下的磁分离:在PBS溶液中的捕获效率高于90%,在生菜样本中的捕获效率高于83%。即使革兰氏阴性菌浓度高达10~6 CFU/mL时,对单增李斯特菌的捕获效率影响也较小(小于25%)。本研究构建的Van-PMs-PCR技术用于检测单增李斯特菌,在PBS溶液和生菜样本中的最低检测限分别为30 CFU/mL和30 CFU/g;整个实验能在4 h内完成。该方法展示了其在检测单增李斯特菌或其他革兰氏阳性菌方面潜在的应用价值。第三章:设计了一种新型“三明治”夹心方法检测金黄色葡萄球菌。该方法以抗菌试剂(Van)修饰的磁珠捕获目标菌,荧光标记的IgG作为信号输出探针。其中,Van作为靶向分子能够与革兰氏阳性菌产生较强的相互作用。为有效提高金黄色葡萄球菌的富集效率,以BSA作为放大载体修饰于磁珠的表面,制备Van-BSA-MBs复合物。为保证特异性,采用FITC标记的猪源IgG作为第二识别分子和信号输出探针;特异性识别是基于金黄色葡萄球菌表面蛋白A与猪源IgG的Fc片段特异性识别。最后通过FCM检测FITC的荧光信号实现金黄色葡萄球菌的检测。本研究构建的多价磁性纳米探针在目标菌浓度为33 CFU/mL时,其捕获效率高达98%。这种新型“三明治”夹心法检测金黄色葡萄球菌的最低检测限为33 CFU/mL,检测时间约为120 min。其它革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,包括单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、克罗诺杆菌、大肠杆菌O157:H7,以及肠炎沙门氏菌对于金黄色葡萄球菌检测的干扰可以忽略不计。本研究建立的金黄色葡萄球菌的检测方法具有灵敏度高、操作方便、耗时短,以及成本低等特点。第四章:建立了一种基于Van-磁性纳米粒子的新型多价结合方法用于简便、快速和超灵敏分离和检测牛奶中致病菌。制备并采用Van功能化的聚酰胺(胺)树枝状分子(PAMAM)作为多价反应媒介,特异性靶向目标菌,实现牛奶样本中致病菌的捕获。链霉亲和素(SA)修饰的磁珠用于分离Van-细菌复合物,最终通过多重荧光定量PCR(m-qPCR)实现目标菌的定量检测,该方法能够在2 min内达到同时富集两种目标菌的效果。基于Van-PAMAM的磁性纳米平台结合m-qPCR方法检测单增李斯特菌时的线性范围是3.2×10~1–3.2×10~6 CFU/mL,检测金黄色葡萄球菌时的线性范围是4.1×10~1–4.1×10~6 CFU/mL;最低检测限分别为32 CFU/mL和41 CFU/mL。本研究建立的方法在同时检测中展示出较高的灵敏度和特异性,其它革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌对单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的同时检测影响较小。本研究首次利用Van作为识别分子实现了两种革兰氏阳性菌的同时检测。