副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，简称Vp)隶属于弧菌科弧菌属，是一种革兰氏阴性嗜盐菌，广泛分布于近海区域、盐湖及鱼、贝类等海产品中，是沿海地区引起食物中毒的重要病原菌。食用被副溶血弧菌污染的海产品可导致患者出现腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应，严重者可引起败血症甚至死亡。目前，副溶血弧菌引起食物中毒的发生规模以及人群暴露规模呈明显上升趋势，已成为我国首要的食源性致病菌。目前研究认为副溶血弧菌最重要的致病因子是其产生的多种溶血毒素，主要有耐热的直接溶血毒素（Thermostable direct hemolyticus, TDH），相对耐热的直接溶血毒素（Tdh-related hemolysin, TRH）和不耐热溶血毒素（Themolabile hemolysin, TLH），它们分别由tdh，trh和tlh基因编码，tlh（不耐热溶血毒素）和tdh（耐热直接溶血毒素）是副溶血弧菌主要的毒力基因。常用的副溶血弧菌检测方法包括传统培养方法、免疫学方法以及PCR等分子生物学方法，但这些方法在特异性、灵敏度、检测周期、操作难易度以及检测成本等方面各有缺点。实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR）技术是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种通过检测荧光信号的变化进行核酸定量的技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程的技术。与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。本研究将实时荧光定量PCR技术应用于检测副溶血弧菌两种毒力基因tlh和tdh的表达变化上，建立了一种针对副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因（tlh）和耐热的直接溶血毒素基因（tdh）毒力表达变化的检测方法，通过比较毒力基因在不同应激条件下表达量的变化可以间接比较菌株的毒力差异，进而研究环境对副溶血弧菌致病力的影响。本文以在不同条件下培养的三株Vp为材料，分别提取其总RNA，以16SrRNA为内标基因，运用荧光定量PCR技术检测副溶血弧菌TLH和TDH基因在不同应激条件下的表达差异。结果表明：1、本研究比较了四种提取副溶血弧菌总RNA的方法，以PureLinkTM RNA Mini Kit所得的总RNA质量最佳，对PCR反应的影响最小，其次是Trizol法，尽管总RNA浓度不及PureLinkTM RNA Mini Kit，但纯度跟PureLink试剂盒不相上下，且PCR结果也较好。在所比较的四种方法中：PureLinkTM RNA Mini Kit和Uniq-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒是市面常用的试剂盒，优点是简便快速，试剂简单，对于标本量大、灵敏度要求不高的PCR反应则不失为简单快捷的方法，但价格较贵。Trizol法和SDS法为传统的经典RNA纯化方法，这两种方法的优点是样本裂解较充分，蛋白质消化较完全；缺点是提取步骤较多，反应时间较长，但所用试剂较普通试剂盒便宜，所以更适合于广大普通实验室进行细菌总RNA的提取工作。2、本研究建立了一套检测副溶血弧菌毒力基因表达差异的方法。16S是所有细菌都具有的基因片段，它在不同来源的副溶血弧菌中很保守，且该基因表达很稳定。本研究选用16S基因片段作为比较副溶血弧菌tlh和tdh基因表达差异的内标。通过引入内标，就可以进一步确定RNA量和反转录得到的cDNA量的一致性。反转录PCR有一步反应和两步反应法，本研究比较了这两种方法，最终确定两步反应法为使用方法，即将反转录反应和PCR分两步进行，避免在实验过程中出现由于初始提取的总RNA质量欠佳所导致的后期实验失败的情况，对整个实验流程起到良好控制作用。3、通过运用SPSS统计学软件对研究结果进行分析，得出以下结论：（1）影响tlh基因表达的因素之间的关系：菌株>盐度>温度；（2）影响tdh基因表达的因素之间的关系：菌株>温度>盐度。综合所有因素，进一步比较，可以得出以下结论：盐度对tlh的影响大于对tdh的影响；温度对tlh的影响小于对tdh的影响；菌株对tlh的影响大于对tdh的影响。4、本研究通过对实验结果的比较，得出：菌株的不同，即菌株内部转录调节因子的不同对毒力基因的表达影响最大。其次是环境因素的影响，包括温度、盐度、酸碱度等。且不同的环境条件对不同毒力基因表达的影响程度不一致，在研究中，我们可以通过比较毒力基因表达量的大小来间接比较该致病菌的毒力大小。进而通过改变环境条件来改变该菌的致病力，从而为研究副溶血弧菌的致病性以及基因表达与环境适应性之间的关系打下基础。