口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinima, OSCC)是头颈部常见的恶性肿瘤,约占口腔恶性肿瘤的80%以上。近年来,其发病率明显增高,且发病低龄化,已成为威胁人类健康的重要因素之一。目前,口腔癌的治疗以手术为主,辅助放射治疗及化学治疗。但由于多药耐药(Multidrug resistant, MDR)的产生,导致癌细胞对化疗药物敏感性降低,而研究证明,肿瘤细胞这种多药耐药的产生,不但与包括P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)在内的膜泵出蛋白的过表达密切相关,同时与癌细胞的抗凋亡作用增强有关。P-gp是ATP-结合盒超家族(ATP-binding Cassette superfamily, ABC)的一种跨膜磷酸糖蛋白,由人类MDR-1基因编码。许多研究证实,不同个体之间的MDR-1基因存在差异,但在治疗前MDR-1基因的多态性并不影响细胞对药物的转运和患者病情的发展。当肿瘤细胞长期与抗肿瘤药物接触时,MDR-1基因被诱导扩增并且大量表达P-gp。P-gp具有ATP依赖性药物外排泵的功能,其作用底物可以是内源性的物质(如细胞因子、类固醇激素等),也可以是外源性的物质(如化疗药物等)。P-gp可以将大量化合物,尤其是水合阳离子化合物从细胞内泵至细胞外间隙,从而导致细胞内P-gp作用底物浓度的降低,直接降低药效。当肿瘤细胞与抗肿瘤药物接触时,脂溶性药物通过浓度梯度而进入细胞内,在细胞内药物与P-gp结合后,P-gp通过水解ATP获得的能量可将细胞内的化疗药物逆浓度阶梯排出细胞外,从而不断降低细胞内的药物浓度,使药物对肿瘤细胞的毒副作用减弱,甚至消失,最终产生耐药性。P-gp并不是人体的异常蛋白,其可在多种组织中表达,如脑、肝、肠道、肾脏、肾上腺和睾丸等,还可在外周血白细胞上表达,包括T、B淋巴细胞和自然杀伤细胞等。不同组织细胞中P-gp的作用不同,如在肠道主要影响药物的吸收,在肝脏和肾脏则影响药物的代谢与排除,在中枢神经系统和循环系统则影响药物的分布,它可降低细胞内的药物浓度从而保护机体免受药物的损害。但在人恶性肿瘤的研究中发现,P-gp的表达水平与肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性降低密切相关。环氧化酶(Cyclooxygenase, COX)又称前列腺素内过氧化物合成酶(Prostaglandin endoperoxide synthase, PGEs).是催化花生四烯酸转化为前列腺素(prostaglandin, PG)过程中的限速酶,直接影响PG的合成并参与机体的许多生理和病理过程。目前发现COX有两个亚型,即COX-1和COX-2。COX-1是一种持续表达于许多组织细胞内的“结构酶”,能促进生理性前列腺素的合成,维持和调节组织细胞正常的生理活动,在维持自身稳定等方面具有重要的作用,如保护胃黏膜、调节肾血流量及血小板功能等。COX-2又称前列腺素内过氧化物合成酶-2,是COX的诱导型。除了在中枢神经系统、肾脏和精囊,大多数正常组织中检测不到COX-2,但当机体受到不同的炎症反应和促有丝分裂刺激后,便可产生COX-2,催化合成PG并参与炎症反应。各种生长因子(EGF、PDGF)、致炎细胞因子、内毒素、一氧化氮、致癌剂、胆汁酸和紫外线等均为COX-2表达的刺激因素。目前认为,COX-2的过表达与包括口腔癌在内的恶性肿瘤的发生、发展有关,其影响的方面包括肿瘤发生、细胞外基质的黏附性增强、抗细胞凋亡作用、降低E-cadherin和TGF-β2受体的表达以及增强Bcl-2蛋白的表达等。此外COX-2的过表达还与调节细胞生长、分化以及大量产生血管生成因子产生从而刺激血管形成有关。细胞凋亡是细胞内在的决定细胞发育和组织平衡的一个重要机制,对于维持细胞衰老死亡和细胞增殖之间的平衡具有重要意义。细胞凋亡与细胞分裂、细胞分化类似,受细胞内多种基因的调控,是一个级联式基因表达的结果。Bcl-2是致癌基因的一种,它与延长细胞寿命、肿瘤进展和抑制凋亡有关的。Bcl-2蛋白家族成员是细胞凋亡过程中的重要调控分子,它分为促凋亡蛋白组(Bax, Bak, Bad, Bid)和抗凋亡蛋白组(Bcl-2, Bcl-x, Mcl-1)。Bcl-2、Bcl-xl蛋白的过度表达是肿瘤发生及产生耐药性的重要原因之一。促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之间的平衡与细胞凋亡密切相关,多数肿瘤中Bcl-2表达水平升高,而Bax表达下降。上调Bcl-2或下调Bax能抑制多种因素诱导的多种肿瘤细胞凋亡。反之,下调Bcl-2或上调Bax促进多种肿瘤细胞凋亡。近年来研究发现,COX-2的表达与凋亡的抑制相关。选择性COX-2抑制剂除可抑制许多类型癌细胞的生长及诱导细胞凋亡外,还能增强抗肿瘤药物对癌细胞的毒性作用。COX-2抑制剂的抗肿瘤活性的作用机制包括抑制细胞分裂周期、诱导细胞凋亡和抑制肿瘤新生血管生成等,研究认为低浓度的COX-2抑制剂通过降低P-gp, Bcl-xL和Bcl-2的表达,并诱导Bax从蛋白胞浆易位致线粒体,以及细胞色素C释放到细胞质,导致caspase-3激活,促进细胞凋亡,从而增强肿瘤对化疗药物的敏感性。我们的前期研究证实,选择性COX-2抑制剂塞来昔布可增强人口腔癌耐长春新碱细胞株KB/VCR细胞对长春新碱的敏感性,其作用与抑制P-糖蛋白的表达和功能有关。本实验在前期研究的基础上,观察塞来昔布增强KB/VCR细胞对长春新碱的敏感性与诱导细胞凋亡的相关性。第一章塞来昔布增强长春新碱对KB/VCR细胞的生长抑制作用目的：研究选择性COX-2抑制剂塞来昔布与长春新碱联合应用后能否增强长春新碱对人口腔癌耐长春新碱细胞株KB/VCR细胞的生长抑制作用。方法：收集对数生长期的KB/VCR细胞,以2×103个/孔浓度分别接种于96孔板,常规培养24h,细胞贴壁后将含长春新碱的培养基,浓度分别为0.375、0.75、1.5和3μmol/L,及不含长春新碱的培养基(对照组),分别加入接种于96孔板的KB/VCR细胞中,培养24、48和72h后,进行MTT实验检测计算细胞生长抑制率,并比较长春新碱对KB/VCR细胞生长抑制率的差异。MTT实验检测不同浓度的塞来昔布(10、20、40和80μmol/L)作用于KB/VCR细胞24、48和72h后的生长抑制率。本研究采用塞来昔布(10μmol/L)、长春新碱(1.5μmol/L)、塞来昔布+长春新碱(10μmol/L+1.5μmol/L)作用于KB/VCR细胞,24、48和72h后,MTT法测定各组药物处理对KB/VCR细胞的生长抑制率。抑制率=1-加药组OD殖/对照组OD殖。结果：MTT实验结果显示,KB/VCR细胞经不同浓度的长春新碱处理24、48及72h后,其对KB/VCR细胞的生长抑制作用,随着药物浓度的增加及作用时间的延长而增强,呈现明显的时间及剂量依赖性(P<0.01),但长春新碱在较低浓度(0.375μmol/L)时作用24、48和72h后,其对KB/VCR细胞的生长抑制率差异无统计学意义(F=3.040,P=0.098)。不同浓度的塞来昔布处理KB/VCR细胞24、48及72h后,其对KB/VCR细胞的生长抑制作用,随着药物浓度的增加及作用时间的延长而增强,呈现明显的时间及剂量依赖性(P<0.01),但塞来昔布在较低浓度(10μmol/L)时作用24、48和72h后,其对KB/VCR细胞的生长抑制率差异无统计学意义(F=1.133,P=0.364)。塞来昔布(10μmol/L)联合长春新碱(1.5μmol/L)作用于KB/VCR细胞24、48及72h后,其生长抑制率高于塞来昔布和长春新碱单独用药组,差异有统计学意义(P均<0.01)。结论：小剂量选择性COX-2抑制剂塞来昔布(10μmol/L)与抗癌药物长春新碱联合应用后,可显著增强长春新碱对KB/VCR细胞的生长抑制作用。第一章塞来昔布增强KB/VCR细胞对长春新碱敏感性与诱导凋亡的相关性研究目的：研究选择性COX-2抑制剂塞来昔布增强KB/VCR细胞对长春新碱的敏感性与诱导凋亡的相关机制。方法：将KB/VCR细胞分别采用不同药物浓度的长春新碱(0.375、0.75、1.5和3μmol/L塞来昔布(10、20、40和80μmol/L)及长春新碱联合塞来昔布(1.5μmol/L+10μmol/L)处理24h后,采用Annexin V-FITC/PI双标法流式细胞术检测KB/VCR细胞的早期凋亡率。用长春新碱(1.5μmol/L)、塞来昔布(10μmol/L)及长春新碱联合塞来昔布(1.5μmol/L+10μmol/L)处理细胞24h,Western blot检测抗凋亡蛋白Bcl-xl和Bcl-2的表达。结果：流式细胞术检测结果显示联合用药组处理KB/VCR细胞24h后的早期凋亡率显著高于长春新碱单独用药组(P均<0.01)。Western Blot结果显示联合用药组较其他单独给药组明显下调Bcl-2和Bcl-xl的表达(P均<0.01)。结论：COX-2抑制剂塞来昔布可通过下调抗凋亡蛋白Bcl-2及Bcl-xl的表达、诱导细胞凋亡增强KB/VCR细胞对长春新碱的敏感性。综上所述,选择性COX-2抑制剂塞来昔布可增强KB/VCR细胞对长春新碱的毒副作用,其作用机制可能与下调抗凋亡蛋白Bcl-2及Bcl-xl的表达、诱导增强KB/VCR细胞凋亡有关。